一种人CK18蛋白检测试剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种CK18检测试剂及制备方法，特别是采用乳胶增强免疫比浊法检测CK18的试剂及制备方法，包括试剂R1、试剂R2以及校准品，其中试剂R1包含反应促进剂、防腐剂、表面活性剂、稳定剂、电解质及缓冲液；试剂R2包含结合有抗CK18单克隆抗体和多克隆抗体的胶乳颗粒、防腐剂、表面活性剂、稳定剂、电解质及缓冲液；校准品包含防腐剂、电解质、稳定剂、CK18纯品及缓冲液。本发明专利技术采用单克隆抗体和多克隆抗体复合包被胶乳颗粒的方法保证了试剂盒的高灵敏度和宽线性范围，同时还具有准确度高、重复性好、特异性强、操作简单等优点，可用于临床常用的全自动生化分析仪。

A human CK18 protein detection reagent and its preparation method

The invention relates to a CK18 detection reagent and a preparation method, in particular the reagent and preparation method for detecting CK18 by latex enhanced immunoturbidimetry, including reagent R1, reagent R2 and calibrator, in which the reagent R1 contains reaction accelerators, preservatives, surfactants, stabilizers, electrolytes and buffer solutions; the reagent R2 contains a junction. Latex particles, preservatives, surfactants, stabilizers, electrolytes and buffers with anti CK18 monoclonal antibodies and polyclonal antibodies; the calibrators include preservatives, electrolytes, stabilizers, CK18 products and buffers. The invention uses the monoclonal antibody and polyclonal antibody to package the latex particles to ensure the high sensitivity and wide linear range of the kit. At the same time, it has the advantages of high accuracy, good repeatability, strong specificity, simple operation and so on. It can be used in the automatic biochemistry analyzer which is commonly used in clinical practice.

【技术实现步骤摘要】
一种人CK18蛋白检测试剂及其制备方法
本专利技术涉及一种细胞角蛋白18(CK18)检测试剂及制备方法，特别是采用乳胶增强免疫比浊法检测CK18的试剂及制备方法，可应用在检验医学领域。
技术介绍
CK18是细胞骨架蛋白的一种，除了起到细胞骨架的支撑作用以外，还通过多种途径参与着细胞内的各种反应。CK18作为肝细胞凋亡的指标，在包括非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的很多肝脏疾病中都有升高，并且与NAFLD患者肝细胞的脂肪变性、小叶炎症、气球样变的程度及纤维化程度相关，同时有中重度纤维化患者的血清CK18水平明显高于轻度或无纤维化患者的水平。肝病是威胁人类健康的重大问题，脂肪肝、药物性肝损伤、自体免疫性肝病等发病率逐年上升，相当数量的上述肝病患者最终发展为肝纤维化。肝纤维化是所有肝脏慢性疾病的共同通路，早中期可逆转，晚期即肝硬化不可逆转，最终发展为肝功能衰竭危及生命，因此肝纤维化早期诊断意义重大。CK18作为一个无创性的检测手段，在NAFLD的诊断、NAFL和HASH的鉴别及纤维化程度的判断上有重要临床价值。对于CK18定量检测，现有的检测方法主要有有双抗夹心法(ELISA)、免疫发光法。ELSA的灵敏度较高，但其操作复杂，反应测定时间长，且线性范围窄，对于样品稀释度不好控制；化学发光法具有灵敏度高的优点，但是需要配套专门仪器使用，价格昂贵，不利于各级医院推广，而且标准曲线会随着时间漂移。胶乳增强免疫比浊法具有操作简单、快速、灵敏度高、可应用于自动生化分析仪等优点，如能开发出可在全自动生化分析仪上使用的免疫比浊试剂用于检测血清中的CK18，将为临床在NAFLD的诊断及治疗提供强有力的支持。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足和缺点，提供一种具有高灵敏度和宽线性范围的CK18检测试剂，同时还具有测值准确，操作简单、快速可用于门急诊检测且仪器适用面广等优点，所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，其中：a)试剂R1包含防腐剂、稳定剂、表面活性剂、反应促进剂、电解质和缓冲液；b)试剂R2包含结合有抗CK18单克隆抗体和多克隆抗体的胶乳颗粒、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、电解质和缓冲液；c)校准品包含防腐剂、稳定剂、电解质、CK18纯品和缓冲液。特别地，本专利技术涉及一种单多抗复合的胶乳增强免疫比浊试剂用于测定血清CK18，包括试剂R1、试剂R2和已知浓度的CK18抗原校准品，其中：a)本专利技术所述试剂盒的试剂R1是一种使样本中CK18特异的抗原位点充分暴露，有利于与抗CK18抗体充分结合的，包含占其质量百分比为：0.01％～1.0％防腐剂、0.05％～5.0％的稳定剂、0.01％～3.0％的表面活性剂、0.01％～10.0％的反应促进剂、0.01％～5.0％的电解质、pH6.5～8.5的10～200mmol/L的缓冲液；b)本专利技术所述试剂盒的试剂R2包含结合有鼠抗人CK18单克隆抗体和鸡抗人CK18多克隆抗体的胶乳颗粒，可特异性识别并结合血清中的CK18抗原，包含占其质量百分比为：0.1％～0.8％的50～250nm胶乳颗粒、0.01％～1.0％防腐剂、0.05％～15.0％的稳定剂、0.01％～3.0％的表面活性剂、0.01％～5.0％的电解质、pH6.5～8.5的10～200mmol/L的缓冲液；c)本专利技术所述的CK18校准品，用来与样本比较进行结果计算，包括占其质量百分比为：0.01％～1.0％防腐剂、0.05％～5.0％的稳定剂、0.01％～5.0％的电解质、根据需要的CK18校准品浓度添加的相应量的CK18纯品及pH6.5～8.5的10～100mmol/L的缓冲液。本专利技术所述的CK18校准品中使用的CK18纯品是通过重组表达获得。本专利技术采用单克隆抗体和多克隆抗体复合包被胶乳颗粒的方法，可以同时保证高线性和灵敏度，与现有的CK18试剂盒相比较，测定结果准确性大大提高。本专利技术中所使用的抗CK18单抗为鼠抗人单克隆抗体，抗CK18多抗为鸡抗人多克隆抗体，特别地，本专利技术所使用的鼠抗人CK18单克隆抗体可以多于一种，即可以为几种抗CK18特异性单抗的混合，以识别更多的抗原表位，使得所述试剂盒具有更高的灵敏度。本专利技术中所使用的鼠抗人CK18单抗、鸡抗人CK18多抗，对于本领域技术人员而言可购得或制备。本专利技术所述试剂盒的试剂R2中胶乳颗粒与抗CK18单克隆抗体的结合可以采用物理吸附法或化学交联法制备，优选化学交联法。本专利技术中所使用的反应促进剂可以是聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、溴化乙二甲胺、聚凝胺的一种或几种，优选聚乙二醇6000。本专利技术中所使用的防腐剂选自叠氮钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、ProClin300中的一种或几种，优选ProClin300。本专利技术中所使用的电解质可以是钠离子或镁离子，优选钠离子。本专利技术中所使用的缓冲液可以是甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液、硼酸盐缓冲液或磷酸缓冲液、优选甘氨酸缓冲液。本专利技术中所使用的表面活性剂为非离子型表面活性剂和/或阴离子型表面活性剂，优选地，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂和阴离子型表面活性剂的复配使用，其中非离子型表面活性剂选自Tween20、Tween40、Tween60、Span40、Span80、TritonX-100中的一种或几种，阴离子型表面活性剂选自SDS、脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠、聚茴脑磺酸钠、脱氧胆酸钠中的一种或几种。本专利技术中所使用的稳定剂选自蛋白质、无机盐、金属络合剂、助悬剂和抗氧化剂中的一种或几种。特别的，所述的蛋白质为牛血清白蛋白或明胶；所述的无机盐选自氯化钠、氯化钾或氯化镁中的一种或几种，优选氯化钠；所述的金属络合剂为含有氨基二乙酸基团的络合剂，选自EGTA、EDTP、DTPA、EDTA中的一种或几种；所述的助悬剂选自乙二醇、丙三醇、乳糖、蔗糖、麦芽糖中的一种或几种；所述抗氧化剂选自2，6-二叔丁基对甲酚、叔丁基对羟基茴香醚、没食子酸丙酯中的一种或几种。本专利技术采用胶乳增强免疫比浊法，开发出可检测血清和尿液中CK18的试剂.胶乳增强免疫比浊法的反应原理是：包被了高特异性抗体的胶乳颗粒，与样本中相应的CK18抗原发生特异性结合，形成不溶性的抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的CK18抗原浓度成正比关系，在一定波长下进行浊度测定，即可测得样本中被检测CK18的含量。本专利技术中，选取的检测波长为340-800nm，优选500-750nm。采用本专利技术所述的试剂盒测定血清或尿液中CK18时，先将样本与试剂R1混匀后孵育5分钟，然后加入试剂R2，测定反应第0.5分钟和第5分钟的吸光度值(A1、A2)，计算吸光度差值，根据校准曲线得到样本中CK18的含量。本专利技术采用6点定标法，以样条函数作为计算模式，绘制出校准曲线。本专利技术所述的试剂盒，用于测定血清中CK18，与现有技术相比，具有特异性好、灵敏度高、准确性好、线性范围宽等优点；另外，进行检测时操作简便适用于全自动生化分析仪，大幅度提高了检测效率。附图说明图1：由实施例1得到的本专利技术试剂盒1与ELISA试剂盒A测定结果的相关性。图2：由实施例2得到的本专利技术试剂盒2与进口试剂盒B测定结果的相关性。具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人CK18检测试剂，包括试剂R1、试剂R2和已知浓度的CK18抗原校准品，其中：a)试剂R1包含表面活性剂、反应促进剂、防腐剂、稳定剂、电解质和缓冲液；b)试剂R2包含结合有抗CK18单克隆抗体和多克隆抗体的胶乳颗粒、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、电解质和缓冲液；c)校准品包含防腐剂、稳定剂、电解质、CK18纯品和缓冲液。

【技术特征摘要】
1.一种人CK18检测试剂，包括试剂R1、试剂R2和已知浓度的CK18抗原校准品，其中：a)试剂R1包含表面活性剂、反应促进剂、防腐剂、稳定剂、电解质和缓冲液；b)试剂R2包含结合有抗CK18单克隆抗体和多克隆抗体的胶乳颗粒、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、电解质和缓冲液；c)校准品包含防腐剂、稳定剂、电解质、CK18纯品和缓冲液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述抗CK18单克隆抗体为鼠抗人单克隆抗体，抗CK18多克隆抗体为鸡抗人多克隆抗体。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述胶乳颗粒为粒径在50～250nm之间的聚苯乙烯胶乳，胶乳颗粒占试剂R2的质量百分比为0.1％～0.8％。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和已知浓度的CK18抗原校准品，其中：a)试剂R1包含质量百分比为：0.01％～1.0％防腐剂、0.05％～5.0％的稳定剂、0.01％～3.0％的表面活性剂、0.01％～10.0％的反应促进剂、0.01％～5.0％的电解质和pH6.5～8.5的10～200mmol/L的缓冲液；b)试剂R2包含0.1％～0.8％的结合有抗CK18抗体的50～250nm胶乳颗粒，还包含质量百分比为：0.01％～1.0％防腐剂、0.05％～15.0％的稳定剂、0.01％～3.0％的表面活性剂、0.01％～5.0％的电解质和pH6.5～8.5的10～200mmol/L的缓冲液；c)校准品包含质量百分比为：0.01％～1.0％防腐剂、0.05％～5.0％的稳定剂、0.01％～5.0％的电解质、根据需要的校准品浓度添加的相应量的CK18纯品及pH6.5～8.5的10～100mmol/L的缓冲液。5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的稳定剂选自蛋白质...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈菲，周鹏飞，霍如松，
申请(专利权)人：苏州和锐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32