喹啉咔唑类荧光染料及其制法和应用，所述的荧光染料具有结构通式I，其中，所述的Y‑选自卤素负离子，即I‑、Cl‑和Br‑，尤其优选I‑。本发明专利技术所提供的喹啉咔唑类荧光染料是一类双光子荧光染料，对PBS缓冲溶液和活细胞中的mtDNA具有高效且专一的识别能力，并具备较高的光稳定性和较低的生物毒性。另外，该类化合物制备路线简单，易于产业应用。
Quinoline carbazole fluorescent dyes and their preparation and Application
The fluorescent dye of quinoline carbazole, its preparation and application, the fluorescent dye has a general structure I, in which the Y is selected from the negative halogen anion, that is, I, Cl and Br, especially the preferred I. The quinoline carbazole fluorescent dyes provided by the invention are a class of two-photon fluorescent dyes, which have high efficient and exclusive recognition for the PBS buffer solution and the mtDNA in living cells, and have high photostability and lower biological toxicity. In addition, the route of preparation is simple and easy to be applied in industry.
【技术实现步骤摘要】
喹啉咔唑类荧光染料及其制法和应用
本专利技术涉及一种mtDNA特异性识别的双光子荧光探针及其制备和应用方法，属于精细化工领域。
技术介绍
人线粒体基因组(mtDNA)是人类基因组首先被测序的重要组成部分，它包括16569个碱基对，为双链闭环结构。其中，mtDNA编码的酶和蛋白质与其他核DNA编码的蛋白质一起，组成完整的电子传递链，完成细胞呼吸功能，为细胞提供能量。由于mtDNA无内含子结构，缺乏组蛋白的保护，暴露在高活性氧的环境中时，其突变率与核DNA相比，高达10倍以上。众多研究表明，mtDNA的突变与众多疾病相关，包括卡恩斯赛尔综合征、莱波氏世袭视神经病变、慢性进行性外眼肌瘫痪等。因此，实时追踪检测mtDNA的损伤具有重大的意义。荧光探针由于可以对生物分子直接量化，具有直观可视化的动态信息等优点，已经成为生物传感和生物成像领域不可或缺的工具。目前，已有众多研究用于细胞内核酸成像。然而绝大多数的研究与核DNA有关，对mtDNA的研究则相对较少。通常，mtDNA的检测方法主要有PCR和荧光原位成像，由于其较低的杂交程度和较差的重现性，因此应用方面受到限制。双光子显微镜采用长波长的激光作为双光子激发光源，由于可以有效地避免生物体自发荧光造成的背景干扰，而被广泛应用于细胞和组织成像中。咔唑具有良好的光学性质和较大的双光子吸收截面，可以很好地应用于双光子成像。
技术实现思路
本专利技术目的在于针对现有的mtDNA识别染料存在光稳定性差、毒性较高及专一性较差的缺点，提出一种以甲基化喹啉为mtDNA识别基团，以咔唑为荧光母体的双光子荧光染料。为实现上述目的，本专利技术首先提供一种具有如下结构通式I的喹啉咔唑类荧光染料：其中，所述的Y-选自卤素负离子。进一步地，本专利技术提供上述喹啉咔唑类荧光染料的制备方法，包括如下步骤：(1)咔唑与碘甲烷按照摩尔比1:1-5反应，制备式II的化合物，反应温度为25-30℃，反应时间为0.5-2小时，反应溶剂为无水DMF或无水甲苯；(2)式II的化合物与POCl3按照摩尔比1:1-5反应，制备式III的化合物，反应温度为80-100℃，反应时间为4-10小时，反应溶剂为无水DMF、无水甲苯、DMSO中的一种或多种；(3)式III的化合物与N-溴代丁二酰亚胺(NBS)按照摩尔比为1:1-3反应，制备式IV的化合物，反应温度为25-30℃，反应时间为24-36小时，反应溶剂为乙酸与二氯甲烷或氯仿的混合溶剂；(4)催化剂存在条件下，式IV的化合物与乙烯基吡啶按照摩尔比1:1-1.2在密闭容器中，于100-110℃条件下反应3-5天，制备式V的化合物，反应溶剂选自三乙胺、四氢呋喃或其混合物，所述的催化剂为醋酸钯。(5)2-甲基喹啉与CH3Y按摩尔比1:5-10反应，制备式VI的化合物，反应温度65-110℃，反应时间24-36小时，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、甲苯中的一种或多种；(6)式V的化合物与式VI的化合物按摩尔比1:1-1.2于60-115℃条件下反应制备通式I的化合物，反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、甲苯中的一种或多种。本专利技术所提供的喹啉咔唑类荧光染料是一类双光子荧光染料，对mtDNA具有高效且专一的识别能力，并且具备较高的光稳定性和较低的生物毒性。能够对PBS缓冲溶液和活细胞中的mtDNA具有特异性响应和成像的双光子荧光探针。基于此，本专利技术另一方面提供所述的喹啉咔唑类荧光染料在mtDNA特异性识别和标记中的应用，尤其适用于活细胞中mtDNA的实时追踪成像。本专利技术中的喹啉咔唑类荧光染料与本领域其它现有技术相比，具有如下显著的优势：1)分子合成路线简单、稳定性好，具有良好的细胞膜通透性和双光子特性，并且在生物组织中的穿透能力较强。2)对PBS缓冲溶液(10.0mM,pH＝7.4)和活细胞中的mtDNA具有良好的选择性，并且不受其它常见氨基酸和蛋白质等干扰物的影响。3)在缓冲溶液中响应速度快，响应时间仅为20s，并且可以对活细胞中mtDNA的形态变化进行实时监测。附图说明本专利技术附图7幅：图1为PBS缓冲溶液(10.0mM,pH＝7.4)中，探针CNQ(5.0μM)对mtDNA(0-130.0μg/mL)的荧光滴定图；图2为CNQ的荧光强度与小浓度mtDNA(0.42-2.5μg/mL)的线性关系图；图3为CNQ与mtDNA反应时间曲线图；图4为在不同的氨基酸(Ala,Ile,Lys,Trp,His,Tyr,Asn,Asp,Gly,GSH,Pro,Phe和Val)、蛋白质(HSA和BSA)和YeastRNA都存在时，CNQ对mtDNA的选择性图。图5为商业化双链DNA染料Picogreen与双光子荧光染料CNQ在MCF-7细胞中的复染图：图5a为双链DNA染料Picogreen在MCF-7细胞中荧光成像，接收范围为510-540nm；图5b是探针分子CNQ在MCF-7细胞中荧光成像图，接收范围为600-640nm；图5c为明场图；图5d为Picogreen与CNQ的复染叠加图；图5e和5f分别为图5细胞中横线部分1和2处所对应的两个通道荧光强度对比图。图6为商业化荧光染料Mito-TrackerGreen与双光子荧光染料CNQ的复染图：图6a为Mito-TrackerGreen在MCF-7细胞中荧光成像图，图6b为探针分子CNQ在MCF-7细胞中荧光成像图，图6c为Mito-TrackerGreen和CNQ的复染叠加图，图6d为明场图，图6e为Mito-TrackerGreen和CNQ的复染系数图，图6f、6g和6h为图6细胞中横线1、2和3所示区域荧光强度图。图7为双光子荧光染料CNQ对阿霉素诱导损伤的mtDNA的实时追踪和成像：图7a、7b、7c和7d分别为阿霉素浓度为0、2.0、5.0、和10.0μM的条件下孵育MCF-7细胞4小时后探针分子CNQ的荧光成像图，图7e、7f、7g和7h分别为7a、7b、7c和7d的放大。具体实施方式本专利技术中，所述的喹啉咔唑类荧光染料，具有如下结构通式I：其中，所述的Y-选自卤素负离子。具体地，所述Y-可举例选自但不限于I-、Cl-和Br-。作为举例的代表性优选化合物在Y-为I-时获得，为化合物CNQ，具有如下结构式：该探针分子CNQ在与mtDNA结合后，其荧光强度有较大的提升，而且可以对活细胞中mtDNA的损伤进行实时追踪成像，以达到在生理环境中、温和条件下、高选择性、检测方便的目的。化合物CNQ的合成路线如下所示:化合物CNQ的制备方法包括如下步骤：a)以化合物1和碘甲烷为原料，制备化合物2，反应溶剂为无水DMF或甲苯，反应时间为1-2小时，反应温度为25-30℃；b)化合物2与三氯氧磷在DMF溶液中反应，从而制备化合物3，反应溶剂为DMF或无水甲苯，反应温度80-100℃，反应时间为4-10小时；c)化合物3与N-溴代丁二酰亚胺(NBS)反应，制备化合物4，反应溶剂为氯仿和乙酸的混合溶剂，反应温度为25-30℃，反应时间为24-36小时；d)化合物4与乙烯基吡啶反应制备化合物5，反应溶剂为三乙胺和四氢呋喃混合溶剂，密闭反应釜中100-110℃下，反应时间为3-4天；e)2-甲基喹啉与CH3I按照摩尔比1:5-10反应，制备甲基化的2-甲基喹啉化合本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.喹啉咔唑类荧光染料，具有如下结构通式I：
【技术特征摘要】
1.喹啉咔唑类荧光染料，具有如下结构通式I：其中，所述的Y-选自卤素负离子。2.根据权利要求1所述的喹啉咔唑类荧光染料，其特征在于，所述的Y-选自I-、Cl-和Br-。3.权利要求1所述的喹啉咔唑类荧光染料的制备方法，包括如下步骤：(1)咔唑与碘甲烷按照摩尔比1:1-5反应，制备式II的化合物，反应温度为25-30℃，反应时间为0.5-2小时，反应溶剂为无水DMF或无水甲苯；(2)式II的化合物与POCl3按照摩尔比1:1-5反应，制备式III的化合物，反应温度为80-100℃，反应时间为4-10小时，反应溶剂为无水DMF、无水甲苯、DMSO中的一种或多种；(3)式III的化合物与N-溴代丁二酰亚胺(NBS)按照摩尔比为1:1-3反应，制备式IV的化合物，反应温度为25-30℃，反应时间为24-36小时，反应溶剂为乙酸与二氯甲烷或氯仿的混合溶剂；...
【专利技术属性】
技术研发人员：樊江莉，高凤丽，仉华，曹建芳，杜健军，彭孝军，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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