一种基于阻断uPA-uPAR相互作用的药物活性成分筛选和垂钓方法技术

本发明专利技术公开了一种基于阻断uPA‑uPAR相互作用的药物活性成分筛选和垂钓方法，包括：构建FITC标记的uPA探针、构建诱导表达uPAR的酵母表面展示细胞系KM71‑uPAR、构建竞争性抑制uPA‑uPAR结合的中药混合物筛选体系、构建从中药混合物中垂钓靶向uPAR的药物先导化合物体系，采用垂钓的方法进一步分离先导化合物的方法，该方法具有高灵敏度，高通量的特点，并且针对中药混合物中的微量成分能够大量垂钓获得，能一步到位的在受体水平上筛选获得分子作用靶点明确的药物先导化合物。

【技术实现步骤摘要】
一种基于阻断uPA-uPAR相互作用的药物活性成分筛选和垂钓方法
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种从中药混合物中鉴别、分离能够阻断uPA-uPAR相互作用的活性成分，获得药物先导化合物的方法，具体涉及一种基于阻断uPA-uPAR相互作用的药物活性成分筛选和垂钓方法。技术背景现有研究表明，中药中含有数量庞大，结构多样，毒副作用小的化合物，是新药药物先导化合物筛选的一个重要来源。传统的以化合物分离为导向的从中药混合物中筛选、分离活性成份的方法往往费时费力，实验周期长，最后还需要在细胞、器官和动物水平上进行验证。特别是对于中药中的微量活性成分的鉴别、分离难以实现。近年来创新性的“靶点垂钓分离策略”，利用靶点蛋白作为诱饵直接从复杂的中药提取物中准确地，垂钓活性物质，例如：细胞膜色谱、二维涡流色谱、超滤亲和、固定化等相关技术。每种靶点垂钓技术都有自己的优缺点。但是目前这些方法的不足之处在于步骤繁琐，用于靶点垂钓的蛋白质往往不能确证其体外的活性，所垂钓出来的活性物质仅仅是能够结合在靶点蛋白上，这种结合是否具有生物学效应未知，更不能说明是对靶点的激动或拮抗作用，还需要后续的验证及药理药效的评价。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种基于阻断uPA-uPAR相互作用的中药活性成分鉴别、垂钓的方法，根据竞争性抑制后的荧光强度变化为指针，可以直接快速的筛选，进一步垂钓出相应成分。技术方案：为实现上述的专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种基于阻断uPA-uPAR相互作用的药物活性成分筛选和垂钓方法，包括以下步骤：步骤1构建FITC标记的uPA探针：A.采用FITCFastConjugation试剂盒，将FITC偶联到人uPA蛋白上，从而得到FITC标记的uPA配体探针（uPA-FITC）；B.用标记的uPA-FITC探针与uPAR高表达或缺失细胞系孵育，荧光显微镜检测FITC标记后uPA的生物活性、特异性；步骤2构建诱导表达uPAR的酵母表面展示细胞系KM71-uPAR：A.将人uPAR的cDNA连接到质粒pPICZaA-Flo1p，得到重组质粒pPICZaA-Flo1p-Upar；B.将重组质粒通过电击转化导入到毕赤酵母KM71中，筛选阳性克隆菌株；C.优化重组酵母诱导表达条件，以uPA-FITC为探针检测uPAR在酵母表面的表达，用荧光显微镜监测荧光探针的定位；步骤3构建竞争性抑制uPA-uPAR结合的中药混合物筛选体系：优化酵母细胞数量与uPA-FITC荧光探针的比例，加入阳性阻断剂，用生理盐水洗脱未结合的探针，荧光分光光度计检测，得到不同阻断剂加入量与荧光强度变化曲线；步骤4构建从中药混合物中垂钓靶向uPAR的药物先导化合物体系：A.将能够竞争性阻断uPA-uPAR结合的中药混合物与表面展示uPAR的酵母菌共同孵育，通过离心、洗涤去除未结合物质，解离释放出高亲和力单体成分或成分组；B.对于具有高亲和力的成分组，重复步骤3中竞争性抑制活性进行验证，获得高活性的成分。步骤3中，酵母细胞数量与uPA-FITC荧光探针的比例为：每100μL菌液加入终浓度为1μM的探针。步骤4中，A.将能够竞争性阻断uPA-uPAR结合的中药混合物与表面展示uPAR的酵母菌体混合，置于翻转摇床上，37℃孵育30min，1000r/min，离心5min收集菌体，预冷的PBS洗涤菌体两次，通过离心洗涤去除未结合物质，冰水混合浴超声解离释放出高亲和力单体成分或成分组，4℃，1000r/min，离心10min收集上清。步骤4中，B.对高活性的成分进行结构鉴定，对化合物进行确认。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的基于阻断uPA-uPAR相互作用的药物活性成分筛选和垂钓方法，具有以下优势：1）本专利技术采用细胞表面展示的方法建立uPAR的酵母表面展示菌株，将靶点蛋白直接展示在了酵母表面，不需要蛋白的分离纯化及后续的蛋白质固定化操作，最大程度的保持了蛋白在体外的活性。同时采用荧光标记的uPA做为竞争性抑制的探针与uPAR结合，不仅能筛选拮抗剂也能筛选激动剂，并且具有高通量，高灵敏度的特点。2）经过合理优化的结合解离条件，能够利用酵母菌株对中药混合物进行筛选垂钓，能一步到位的在分子水平上筛选得到靶点明确的先导化合物。附图说明图1是本方法的原理示意图；图2是实施例1的uPAR表达菌体验证图；图3是实施例1的菌体浓度与探针比例优化结果图；图4是实施例1的竞争性抑制荧光强度变化曲线图；图5是实施例2的筛选结果图；图6是实施例2的垂钓成分活性验证图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，结合以下实施例，对本专利技术进一步详细说明。实施例1如图1所示，本申请的基于阻断uPA-uPAR相互作用的药物活性成分筛选和垂钓方法，包括以下步骤：步骤1：构建FITC标记的uPA探针：A.采用FITCFastConjugation试剂盒，按照试剂盒提供的方法，将FITC偶联到人uPA蛋白上，从而得到FITC标记的uPA配体探针（uPA-FITC）；B.将标记的uPA-FITC探针分别加入到内源性uPAR高表达细胞系MDA-MB-231（ATCC）或uPAR表达缺失细胞系HEK-293（ATCC）中，37℃下避光孵育30min，PBS洗涤两次，荧光显微镜下经488nm激发，标记的uPA-FITC探针能够特异性的与uPAR高表达细胞MDA-MB-231结合，且分布在细胞细胞表面，说明FITC标记没有影响uPA与uPAR的结合。步骤2：构建诱导表达uPAR的酵母表面展示细胞系KM71-uPAR：A.采用常规的分子克隆技术将人uPAR的cDNA连接到现有质粒pPICZaA-Flo1p，从而得到重组质粒pPICZaA-Flo1p-uPAR；B.将重组质粒通过电击转化导入到毕赤酵母KM71中，经Zeocine（500μg/mL）抗性筛选阳性克隆菌株KM71-uPAR；C.按照重组酵母常规培养方式，添加0.5%甲醇浓度，诱导表达48小时，4℃，1000r/min，离心5min收集菌体，预冷的PBS洗涤菌体两次，PBS重悬。取100μL菌液（菌体浓度1×104/mL），以uPA-FITC为探针检测uPAR在酵母表面的表达，用荧光显微镜监测荧光探针的定位，结果如图2所示，uPAR成功表达在酵母细胞表面。步骤3：构建竞争性抑制uPA-uPAR结合的中药混合物筛选体系：取100μL菌液（菌体浓度1×104/mL），加入终浓度为0.01-100μM的uPA-FITC探针，37℃下避光孵育30min，PBS洗涤两次，荧光分光光度计检测荧光强度。如图3所示，uPA-FITC探针浓度为1μM时，荧光强度达到最大，因此每100μL菌液加入终浓度为1μM的探针作为后续筛选体系条件。按照上述优化后的反应体系，分别加入不同浓度（0.25μM，0.5μM，1μM，2μM，4μM，8μM）阳性阻断剂ATF，用生理盐水洗脱未结合的探针，荧光分光光度计检测，得到不同阻断剂加入量与荧光强度变化曲线。如图4所示，随着阻断剂浓度的增加，荧光强度逐渐减弱，说明阳性阻断剂能够与uPA-FITC探针竞争，阻断了探针与uPAR的结合，该竞争性抑制筛选体系具有很好的响应性。步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于阻断uPA‑uPAR相互作用的药物活性成分筛选和垂钓方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1 构建FITC标记的uPA探针：A.采用FITC Fast Conjugation试剂盒，将FITC偶联到人uPA蛋白上，从而得到FITC标记的uPA配体探针（uPA‑FITC）；B.用标记的uPA‑FITC探针与uPAR高表达或缺失细胞系孵育，荧光显微镜检测FITC标记后uPA的生物活性、特异性；步骤2 构建诱导表达uPAR的酵母表面展示细胞系KM71‑uPAR：A.将人uPAR的cDNA连接到质粒pPICZaA‑Flo1p，得到重组质粒pPICZaA‑Flo1p‑uPAR；B.将重组质粒通过电击转化导入到毕赤酵母KM71中，筛选阳性克隆菌株；C.优化重组酵母诱导表达条件，以uPA‑FITC为探针检测uPAR在酵母表面的表达，用荧光显微镜监测荧光探针的定位；步骤3 构建竞争性抑制uPA‑uPAR结合的中药混合物筛选体系：优化酵母细胞数量与uPA‑FITC荧光探针的比例，加入阳性阻断剂，用生理盐水洗脱未结合的探针，荧光分光光度计检测，得到不同阻断剂加入量与荧光强度变化曲线；步骤4 构建从中药混合物中垂钓靶向uPAR的药物先导化合物体系：A.将能够竞争性阻断uPA‑uPAR结合的中药混合物与表面展示uPAR的酵母菌共同孵育，通过离心、洗涤去除未结合物质，解离释放出高亲和力单体成分或成分组；B.对于具有高亲和力的成分组，重复进行步骤3中竞争性抑制活性进行验证，获得高活性的成分。...

【技术特征摘要】
1.一种基于阻断uPA-uPAR相互作用的药物活性成分筛选和垂钓方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1构建FITC标记的uPA探针：A.采用FITCFastConjugation试剂盒，将FITC偶联到人uPA蛋白上，从而得到FITC标记的uPA配体探针（uPA-FITC）；B.用标记的uPA-FITC探针与uPAR高表达或缺失细胞系孵育，荧光显微镜检测FITC标记后uPA的生物活性、特异性；步骤2构建诱导表达uPAR的酵母表面展示细胞系KM71-uPAR：A.将人uPAR的cDNA连接到质粒pPICZaA-Flo1p，得到重组质粒pPICZaA-Flo1p-uPAR；B.将重组质粒通过电击转化导入到毕赤酵母KM71中，筛选阳性克隆菌株；C.优化重组酵母诱导表达条件，以uPA-FITC为探针检测uPAR在酵母表面的表达，用荧光显微镜监测荧光探针的定位；步骤3构建竞争性抑制uPA-uPAR结合的中药混合物筛选体系：优化酵母细胞数量与uPA-FITC荧光探针的比例，加入阳性阻断剂，用生理盐水洗脱未结合的探针，荧光分光光度计检测，得到不同阻断剂加入量与荧光强度变化曲线；步骤4构建从中药混合物中垂钓靶向uPAR的药物先导化合...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀峰，刘吉华，李丽，黄雅璇，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32