抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合及等位基因的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合及等位基因的筛选方法，该分子标记物包括：第一分子标记物Pid3C1，用于从水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的2209位置出现提前终止位点的水稻材料。第二分子标记物Pid3C2，用于从第一分子标记物的筛余水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的1766位置出现提前终止位点的水稻材料。第三分子标记物Pid3C3，用于从第二分子标记物的筛余水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的1874位置出现变异位点的水稻材料。该方法为合理配置抗稻瘟病基因Pid3不同等位基因、有目的导入特定等位基因以及快速发掘新等位基因等都具有非常重要的作用。

【技术实现步骤摘要】
抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合及等位基因的筛选方法
本专利技术涉及抗稻瘟病基因筛选领域，特别地，涉及一种抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合。此外，本专利技术还涉及一种抗稻瘟病基因Pid3等位基因的筛选方法。
技术介绍
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米为主食。稻瘟病是影响水稻产量的主要病害，位居真菌病害之首，全球每年因稻瘟病造成的水稻减产达10％～30％，严重时减产达40％～50％，甚至颗粒无收。实践证明，利用抗稻瘟病基因是控制稻瘟病害最经济、有效、环保的方法。到目前为止，在水稻中已至少报道了68个抗稻瘟病位点共83个主效基因，这些基因成簇地分布于除第3染色体外的所有水稻染色体上，已经克隆的30个左右，主要包括Pib,Pi-ta,Pi9,Piz-t,Pi2,Pid2,Pi36,Pi37,Rbr2,Pik-m,Pi5,Pid3,pi21,Pit,Pb1,Pish,Pik-p,Pik,Pia,Pi54,Pi25,Pi1,Pi50,Pi54rh，Pigm等(国家水稻数据库中心http://www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm)。在这些已克隆的抗稻瘟病基因中，存在一个显著的特点：许多新克隆的基因其实只是原来克隆的抗病位点中的不同等位基因，比如在Pi9位点上，存在等位基因Pi9、Pi2、Pizt、Pigm；在Pik位点上存在等位基因Pik、Pikp、Pikm、Pi1等。这些等位基因序列高度相似，却具有不同的稻瘟病菌抗谱，在水稻育种中合理利用不同的等位基因是应对稻瘟病菌小种快速变异的有效途径。为了达到该目的，急需解决的首要问题就是如何快速判断水稻材料存在哪一种等位基因。世界上水稻种质资源繁多，目前克隆的某一等位基因可能只是该位点存在众多等位基因中的一种，要准确判断水稻材料中某一抗病基因位点的等位基因，就必须对种质资源中该位点的等位基因存在形式做系统的详细研究，从而利用不同等位基因特异的分子标记进行快速判断。随着3000份水稻基因组重测序计划的完成，使得对抗病位点的等位基因系统研究成为可能。该计划收集了世界上89个国家和地区具有代表性的3000多份水稻材料进行深度达14x的基因组重测序，通过对参考基因组日本晴的比对，提供了整个栽培稻中存在的遗传变异全景图(Alexandrov.,etal.,SNP-SeekdatabaseofSNPsderivedfrom3000ricegenomes.NucleicAcidsResearch,2015(43):D1023-1027)。本方法及相关分子标记就是基于对3000份水稻材料遗传变异的深入分析，针对抗稻瘟病基因Pid3位点鉴定出所有等位基因形式，选取分布最为广泛的4类等位基因，设计特异的分子标记，从而达到区分绝大多数栽培稻中Pid3等位基因的目的。利用该方法，已经成功的对水稻微核心种质资源库中的水稻材料进行了鉴定，取得了非常好的效果。该方法为合理配置抗稻瘟病基因Pid3不同等位基因、有目的导入特定等位基因以及快速发掘新等位基因等都具有非常重要的作用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合及等位基因的筛选方法，以解决抗稻瘟病基因Pid3等位基因筛选的技术问题。本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术一方面提供了一种抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合，包括：第一分子标记物Pid3C1，第一分子标记物用于从水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的2209位置出现提前终止位点的水稻材料。第二分子标记物Pid3C2，第二分子标记物用于从水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的1766位置出现提前终止位点的水稻材料。第三分子标记物Pid3C3，第三分子标记物用于从第一分子标记物的筛余水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的1874位置出现变异位点的水稻材料。进一步地，第一分子标记物Pid3C1包括引物Pid3C1F和引物Pid3C1R，其序列分别为：引物Pid3C1F:ATGATTCATCTTACCCGTCTTGAGATC引物Pid3C1R:GTAATCCCTCAAGATTAAGGAATGC第二分子标记物Pid3C2包括引物Pid3C2F和引物Pid3C2R，其序列分别为：Pid3C2F:GTCTGTTTTGGATCTAACTGATACTTPid3C2R:GCTTTCGAAGTTACAATAAGATGTG第三分子标记物Pid3C3包括引物Pid3C3F和引物Pid3C3R，其序列分别为：Pid3C3F:AAGTTGTTGTCTGTTTTGGAPid3C3R:TGACTACTGTCTGCCTGGAT。一种抗稻瘟病基因Pid3的等位基因的筛选方法，利用上述抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合对抗稻瘟病基因Pid3的等位基因进行筛选，包括以下步骤：1)、利用第一分子标记物Pid3C1或第二分子标记物Pid3C2对水稻材料进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料进行酶切，筛选出能酶切的水稻材料，得到在抗稻瘟病基因Pid3的相应位置出现提前终止位点的水稻材料。2)、从抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合中选择不同于步骤1)中的分子标记物，对步骤1)的筛余水稻材料中进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料进行酶切，筛选出能酶切的水稻材料，得到抗稻瘟病基因Pid3的相应位置出现提前终止位点或变异位点的水稻材料。3)、从抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合中选择剩余的分子标记物，对步骤2)的筛余水稻材料中进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料进行酶切，筛选出能酶切的水稻材料，得到抗稻瘟病基因Pid3的相应位置出现提前终止位点或变异位点的水稻材料。其中，利用第一分子标记物Pid3C1对水稻材料进行扩增的步骤在第三分子标记物Pid3C3对水稻材料扩增的步骤之前。进一步地，在步骤3)之后还包括以下步骤：利用第四分子标记物Pid3对步骤3)的筛余水稻材料中进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料利用引物C1、C2、C3、C4进行测序。其中：第四分子标记物Pid3包括引物Pid3F和引物Pid3R，其序列分别为：Pid3F:CCTGCGTTTTATGAAAGGGGTGAAPid3R:GAACGACAAGTGCGACATGATTG引物C1、C2、C3、C4的序列分别为：C1：AGTAACACCCAAGGATAGGATAGC2:GTATTGAAAGTAAAATTGAACC3：CTCACAATGGCAACTTCGCACCC4：CCAGCCTCATTTCTCTTCACCA。本专利技术第一分子标记物Pid3C1的PCR扩增产物的酶切所用酶为限制性内切酶BglII。第二分子标记物Pid3C1的PCR扩增产物的酶切所用酶为限制性内切酶AflII。第三分子标记物Pid3C1的PCR扩增产物的酶切所用酶为限制性内切酶ApoI。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合是基于对3000份水稻材料遗传变异的深入分析，针对抗稻瘟病基因Pid3位点鉴定出所有等位基因形式，选取分布最为广泛的4类等位基因，设计特异的分子标记，从而达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合，其特征在于，包括：第一分子标记物Pid3C1，所述第一分子标记物用于从水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的2209位置出现提前终止位点的水稻材料；第二分子标记物Pid3C2，所述第二分子标记物用于从水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的1766位置出现提前终止位点的水稻材料；第三分子标记物Pid3C3，所述第三分子标记物用于从第一分子标记物的筛余水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的1874位置出现变异位点的水稻材料。

【技术特征摘要】
1.一种抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合，其特征在于，包括：第一分子标记物Pid3C1，所述第一分子标记物用于从水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的2209位置出现提前终止位点的水稻材料；第二分子标记物Pid3C2，所述第二分子标记物用于从水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的1766位置出现提前终止位点的水稻材料；第三分子标记物Pid3C3，所述第三分子标记物用于从第一分子标记物的筛余水稻材料中检测并筛选出抗稻瘟病基因Pid3的1874位置出现变异位点的水稻材料。2.根据权利要求1所述的抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合，其特征在于，所述第一分子标记物Pid3C1包括引物Pid3C1F和引物Pid3C1R，其序列分别为：引物Pid3C1F:ATGATTCATCTTACCCGTCTTGAGATC引物Pid3C1R:GTAATCCCTCAAGATTAAGGAATGC所述第二分子标记物Pid3C2包括引物Pid3C2F和引物Pid3C2R，其序列分别为：Pid3C2F:GTCTGTTTTGGATCTAACTGATACTTPid3C2R:GCTTTCGAAGTTACAATAAGATGTG所述第三分子标记物Pid3C3包括引物Pid3C3F和引物Pid3C3R，其序列分别为：Pid3C3F:AAGTTGTTGTCTGTTTTGGAPid3C3R:TGACTACTGTCTGCCTGGAT。3.一种抗稻瘟病基因Pid3的等位基因的筛选方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述抗稻瘟病基因Pid3的分子标记物组合对抗稻瘟病基因Pid3的等位基因进行筛选，包括以下步骤：1)、利用第一分子标记物Pid3C1或第二分子标记物Pid3C2对水稻材料进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳检测，将呈阳性的水稻材料进行酶切，筛选出能酶切的水稻材料，得到在抗稻瘟病基因Pid3的相应位置出现提前终止位点的水稻材料；2)、从抗稻瘟病基因Pi...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕启明，黄志远，唐丽，辛业芸，刘海，朱立煌，
申请(专利权)人：湖南杂交水稻研究中心，
类型：发明
国别省市：湖南,43