一种以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法技术

本发明专利技术涉及一种以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，属于大分子检测领域。本发明专利技术提供一种通过十二烷基硫酸钠增敏的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，本发明专利技术利用弱酸环境下，活性红4与壳聚糖分子结合形成的缔合物呈电中性，在此基础上加入十二烷基硫酸钠形成三元缔合物，缔合物体积增大，且疏水性大大提高，可导致在结合产物与水之间形成界面而产生一种表面增强的散射效应，从而使共振瑞利散射强度响应值有明显的提升。且在一定浓度范围内，共振瑞利散射强度与壳聚糖含量在一定的浓度范围内呈线性关系，以此作为壳聚糖的定量基础，建立了测定壳聚糖的共振瑞利散射法。本方法测定受壳聚糖的分子量和脱乙酰度的影响，具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好和操作简便等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法
本专利技术涉及一种以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，属于大分子检测领域。
技术介绍
甲壳素(Chitin)又名几丁质，化学名称为(1，4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，它广泛存在于低等植物菌类细胞壁、虾、蟹、昆虫等甲壳动物的外壳中。甲壳素经浓碱处理脱去其中的乙酰基就变成可溶性甲壳素，又称壳聚糖(Chitosan)，其化学名称为(1，4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖胺，是自然界中存在的唯一的碱性多糖，可溶于醋酸等无机酸的稀溶液中。壳聚糖及其衍生物一般不与体液或者体内组织发生免疫反应，性质比较稳定，具有良好的生物相容性和生物降解性，同时具有止血、抑菌、抗肿瘤，抗凝血，减肥降脂和增强免疫力等功能。因此，壳聚糖在纺织工业、生物医学、日用环保等领域都有着广阔的应用前景。随着壳聚糖在食品领域的广泛应用，市面上的壳聚糖保健品参差不齐，配方不一，壳聚糖所占的含量直接影响到其功能的发挥，因此，壳聚糖的准确定量显得十分重要。目前，国内外用于壳聚糖定量分析的方法有分光光度法、高效液相色谱法、电化学法、荧光猝灭法，还有利用阴离子表面活性剂、阴离子染料、金属离子等作为探针的共振瑞利散射法(RRS)等。共振瑞利散射法应用于壳聚糖定量分析的研究比较少，它是近年来发展起来的一项简便、快速、灵敏的分析技术。虽然目前国内外壳聚糖含量的测定方法很多，但开发出更简便、快速、灵敏度更高的测定壳聚糖含量的新方法成为一种趋势。基于此，本专利技术提供一种以活性红4为探针运用共振瑞利散射技术测定壳聚糖含量的方法。
技术实现思路
为了克服现有技术中对于成品中壳聚糖的含量难以定量，操作技术繁琐的技术不足，本专利技术提供一种通过十二烷基硫酸钠增敏的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，本专利技术利用弱酸环境下，活性红4与壳聚糖分子结合形成的缔合物呈电中性，在此基础上加入十二烷基硫酸钠形成三元缔合物，缔合物体积增大，且疏水性大大提高，可导致在结合产物与水之间形成界面而产生一种表面增强的散射效应，从而使共振瑞利散射强度响应值有明显的提升。且在一定浓度范围内，共振瑞利散射强度与壳聚糖含量在一定的浓度范围内呈线性关系，以此作为壳聚糖的定量基础，建立了测定壳聚糖的共振瑞利散射法。本方法测定受壳聚糖的分子量和脱乙酰度的影响，具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好和操作简便等优点。一种以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，其包括下述步骤：1)绘制△I和不同分子量的壳聚糖浓度的标准曲线向10mL比色管中加入1.0mL一定浓度梯度的壳聚糖标准溶液，1.0mL缓冲溶液，2.0mL浓度为1.72×10-3mol/L的十二烷基硫酸钠溶液，以及1.0mL浓度为2.00×10-5mol/L的活性红4溶液，使用三次蒸馏水定容至刻度，并充分摇匀，将其置于室温室温10min，取1ml混合溶液加入石英比色皿，于F-2500型荧光分光光度计上，以λex＝λem进行同步扫描，分别记录含壳聚糖的各检测体系在最大共振瑞利散射波长λ＝370nm处体系的共振散射强度值I，其中试剂空白在λ＝370nm处体系的共振散射强度值I0，并计算ΔI＝I-I0，建立ΔI与低分子壳聚糖浓度的标准曲线C1；使用中分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔI与中分子壳聚糖浓度的标准曲线C2；使用高分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔI与高分子壳聚糖浓度的标准曲线C3；在最佳的实验条件下，考察该体系对不同分子量的壳聚糖的测定结果。分别考察了低分子量、中分子量和高分子量的壳聚糖。经过统计学分析，不同分子量的壳聚糖结果存在显著差异性，该方法测定壳聚糖含量受不同分子量的影响。2)10μg/mL的样品工作液的制备：将壳聚糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液。3)根据壳聚糖分子量选择标准曲线：使用步骤1)中检测方法绘制ΔI和样品工作液的标准曲线，并将其与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，根据样品的ΔI和样品工作液的标准曲线的回归方程确定样品中的壳聚糖的分子量的大小，根据所对应的壳聚糖的分子量的大小确定所使用的回归方程；4)样品中壳聚糖含量确定：取样品工作液1mL，按步骤1)检测方法进行测定，在λ＝370nm处测定其共振散射强度值I，并计算ΔI＝I-I0，将ΔI代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。如上所述的以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，所述缓冲液为B-R缓冲溶液、HAc-NaAc缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液中的一种；申请人通过实验发现，缓冲溶液的酸度对该反应体系有着显著的影响，在pH＝5.5时散射值较大；并且体系在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中灵敏度最高，散射值最大，故最佳缓冲溶液选择为pH＝5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。如上所述的以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，步骤1中试剂的加入顺序为首先加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，其次加入壳聚糖溶液，再次加入活性红4溶液，最后加入十二烷基硫酸钠溶液。如上所述的以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，步骤1)中壳聚糖的浓度范围0.005-2.50μg/mL。样品前处理：将壳聚糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液。取样品工作液1mL，按实验方法进行测定，在370nm处测定其共振瑞利散射强度值I，并计算ΔI＝I-I0，将ΔI代入线性回归方程，求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。试验例：1.十二烷基硫酸钠-活性红4-壳聚糖体系的共振瑞利散射图谱图1为体系的共振散射光谱图。如图1，从下至上1为十二烷基硫酸钠-活性红4；2-6为十二烷基硫酸钠-活性红4-壳聚糖(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5μg/mL)复合物。由图1可知，未加入壳聚糖的十二烷基硫酸钠-活性红4本身的共振散射非常弱，但是与壳聚糖结合后共振瑞利散射明显增强，这也由于在弱酸环境下，壳聚糖的氨基阳离子与活性红4形成缔合物时呈电中性，在此基础上加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠，形成三元离子缔合物，缔合物体积增大，且疏水性大大提高，可导致在结合产物与水之间形成界面而产生一种表面增强的散射效应，有利于RRS增强，在370nm处呈特征性共振瑞利散射峰。此共振瑞利散射强度与壳聚糖浓度呈线性相关。因此，后续实验选择该波长作为测定波长。2.不同表面活性剂对于体系共振瑞利散射强度的影响实验分别考察了溴化十六烷基、十二烷基硫酸钠、吐温20、吐温80、OP以及聚乙烯醇这六种表面活性剂对共振瑞利散射强度ΔIRRS的影响，结果(见图2)可看出十二烷基硫酸钠对活性红4-壳聚糖二元体系具有增敏效果，故实验采用十二烷基硫酸钠作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，其包括下述步骤：1)绘制ΔI和不同分子量的壳聚糖浓度的标准曲线向10mL比色管中加入1.0mL一定浓度梯度的壳聚糖标准溶液，1.0mL缓冲溶液，2.0mL浓度为1.72×10‑3mol/L的十二烷基硫酸钠溶液，以及1.0mL浓度为2.00×10‑5mol/L的活性红4溶液，使用三次蒸馏水定容至刻度，并充分摇匀，将其置于室温室温10min，取1ml混合溶液加入石英比色皿，于F‑2500型荧光分光光度计上，以λex＝λem进行同步扫描，分别记录含壳聚糖的各检测体系在最大共振瑞利散射波长λ＝370nm处体系的共振散射强度值I，其中试剂空白在λ＝370nm处体系的共振散射强度值I0，并计算ΔI＝I‑I0，建立ΔI与低分子壳聚糖浓度的标准曲线C1；使用中分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔI与中分子壳聚糖浓度的标准曲线C2；使用高分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔI与高分子壳聚糖浓度的标准曲线C3；2)10μg/mL的样品工作液的制备：将壳聚糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液。3)根据壳聚糖分子量选择标准曲线：使用步骤1)中检测方法绘制ΔI和样品工作液的标准曲线，并将其与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，根据样品的ΔI和样品工作液的标准曲线的回归方程确定样品中的壳聚糖的分子量的大小，根据所对应的壳聚糖的分子量的大小确定所使用的回归方程；4)样品中壳聚糖含量确定：取样品工作液1mL，按步骤1)检测方法进行测定，在λ＝370nm处测定其共振散射强度值I，并计算ΔI＝I‑I0，将ΔI代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。...

【技术特征摘要】
1.一种以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，其包括下述步骤：1)绘制ΔI和不同分子量的壳聚糖浓度的标准曲线向10mL比色管中加入1.0mL一定浓度梯度的壳聚糖标准溶液，1.0mL缓冲溶液，2.0mL浓度为1.72×10-3mol/L的十二烷基硫酸钠溶液，以及1.0mL浓度为2.00×10-5mol/L的活性红4溶液，使用三次蒸馏水定容至刻度，并充分摇匀，将其置于室温室温10min，取1ml混合溶液加入石英比色皿，于F-2500型荧光分光光度计上，以λex＝λem进行同步扫描，分别记录含壳聚糖的各检测体系在最大共振瑞利散射波长λ＝370nm处体系的共振散射强度值I，其中试剂空白在λ＝370nm处体系的共振散射强度值I0，并计算ΔI＝I-I0，建立ΔI与低分子壳聚糖浓度的标准曲线C1；使用中分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔI与中分子壳聚糖浓度的标准曲线C2；使用高分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔI与高分子壳聚糖浓度的标准曲线C3；2)10μg/mL的样品工作液的制备：将壳聚糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液。3)根据壳聚糖分子量选择标准曲线：使用步骤1)中检测方法绘制Δ...

【专利技术属性】
技术研发人员：白研，苏政权，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44