用于遗传工程改造的细胞中调节抑制性相互作用的组合物和方法技术

提供了用于过继治疗的工程改造的细胞，包括T细胞。还提供了用于工程改造和产生所述细胞的方法和组合物、含有所述细胞的组合物、以及其给予对象的方法。在一些实施方式中，所述细胞(如T细胞)含有特异性结合抗原的遗传工程改造的抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，所述细胞(如表达CAR的T细胞)包含能够通过阻遏和/或破坏工程改造的细胞中基因(如涉及抑制免疫应答的基因)来减少抑制作用的物质。在一些实施方式中，方法和细胞的特征提供增强的或改善的活性、功效和/或持久性。 1

Compositions and methods for regulating inhibitory interactions in genetically engineered cells

Engineered cells, including T cells, are provided for adoptive treatment. Methods and compositions for engineering transformation and generation of the cells, compositions containing the cells, and methods of giving the objects are also provided. In some embodiments, the cells (such as T cells) contain genetically engineered antigen receptors that specifically bind antigens, such as chimeric antigen receptor (CAR). In some implementations, the cells (such as the T cells expressing CAR) contain substances that can reduce the inhibition by repressing and / or destroying the genes in the engineered cells, such as genes that involve inhibition of the immune response. In some embodiments, methods and cell characteristics provide enhanced or improved activity, efficacy and / or durability. One

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于遗传工程改造的细胞中调节抑制性相互作用的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求于2015年5月29日提交的题为“用于在遗传工程改造的细胞中调节抑制性相互作用的组合物和方法”的美国临时专利申请号62/168,721，以及2015年10月20日提交的题为“用于在遗传工程改造的细胞中调节抑制性相互作用的组合物和方法”的美国专利申请号62/244,132的优先权，其内容通过引用其全文纳入本文。通过引用纳入序列表本申请与电子格式的序列表一同提交。所提供的序列表名称为735042002440seqlist.txt，创建于2016年5月27日，其文件大小为41kb。该序列表的电子格式的信息通过引用其全文纳入本文。
本公开在一些方面涉及用于过继治疗的工程改造的细胞，包括T细胞。在一些方面中，本专利技术还涉及用于工程改造和产生所述细胞的方法和组合物、含有该细胞的组合物、和用于向对象给予它们的方法。在一些实施方式中，所述细胞(如T细胞)包含特异性结合抗原的遗传工程改造的抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，所述细胞(如表达CAR的T细胞)包含一种能够通过阻遏和/或破坏工程改造的细胞中基因(如涉及抑制免疫应答的基因)来降低抑制作用的物质(agent)。在一些实施方式中，方法和细胞的特征提供了增强的或改善的活性、功效和/或持久性。
技术介绍
有多种策略可用于产生并给予用于过继治疗的工程改造的细胞。例如，有策略可用于工程改造表达遗传工程改造的抗原受体(如CAR)的免疫细胞，并且用于阻抑或阻遏细胞中的基因表达。需要改善的策略以改善所述细胞的功效，例如，所述改善通过避免在给予对象之后对效应物功能的阻抑和改善在给予对象后细胞的活性和/或存活来进行。提供了满足此类需求的方法、细胞、组合物、试剂盒和系统。专利技术概述提供了产生或生成表达遗传工程改造(重组)细胞表面受体的细胞的方法，所述细胞用于如过继细胞治疗中，例如，以治疗对象中的疾病和/或病症。还提供了用于这类方法的细胞、组合物和制品。组合物和细胞通常包括这样的物质，其降低PD-L1和/或PD-1表达，或能够造成PD-L1和/或PD-1表达的降低。在一些实施方式中，所述物质是或者包括抑制性核酸分子，例如互补于、靶向、抑制和/或结合编码PD-L1或PD-1的核酸或基因的抑制性核酸分子。在一些实施方式中，所述物质是或者包括含有核糖核蛋白(RNP)复合物的复合物，所述RNP复合体包括Cas9，例如在一些情况中，酶失活的Cas9，以及靶向编码PD-L1或PD-1的基因的gRNA。还提供了向对象给予所提供的细胞的方法，所述细胞表达遗传工程改造(重组)细胞表面受体(如通过本文所述方法产生)，其例如，用于过继细胞治疗以治疗对象的疾病和/或病症。在一些实施方式中，提供了这样的细胞，其包含编码遗传工程改造的抗原受体(如嵌合抗原受体(CAR))的核酸分子以及是或包括或编码这样物质的核酸分子，所述物质降低PD-L1表达，或能够产生PD-L1表达的降低。在一些实施方式中，重组受体是遗传工程改造的抗原受体，如功能性非-TCR抗原受体，例如，嵌合抗原受体(CAR)和其他重组抗原受体如转基因T细胞受体(TCR)。受体还包括其他重组嵌合受体，如含特异性结合配体或受体或其他结合伴侣的胞外部分和胞内信号转导部分(如CAR的胞内信号转导部分)的那些受体。提供了用于在过继细胞治疗中给予对象表达遗传工程改造(重组)细胞表面受体的细胞的方法，例如，以治疗对象中的疾病和/或病症。在任意这些实施方式的一些中，工程改造的T细胞包含特异性结合抗原的遗传工程改造抗原受体；以及这样的物质，其降低PD-L1表达或能够造成PD-L1表达的降低。在一些实施方式中，所述物质包括抑制性核酸分子，如互补于、靶向、抑制和/或结合编码PD-L1的其它核酸或基因和/或编码PD-L1的其它核酸或基因(例如，CD274基因)的抑制性核酸分子。这任意这些实施方式的一些中，抑制性核酸分子包括RNA干扰剂。在任意这些实施方式的一些中，抑制性核酸是或包含或编码小干扰RNA(siRNA)、微小RNA适应性shRNA、短发夹RNA(shRNA)、发夹siRNA、前体微小RNA(前-miRNA)或微小RNA(miRNA)。在任意这些实施方式的一些中，抑制性核酸分子包含与编码PD-L1的核酸互补的序列。在任意这些实施方式的一些中，抑制性核酸分子包含与编码PD-L1的核酸互补的反义寡核苷酸。在一些实施方式中，所述物质包括gRNA，所述gRNA具有与编码PD-L1的基因的靶结构域互补的靶向结构域，以及与之组合的Cas9分子，如酶失活的Cas9(例如eiCas9)，用于减少或阻遏基因表达。在一些实施方式中，所述物质包括核酸分子，其编码至少一个gRNA和/或Cas分子。在一些实施方式中，所述物质包括Cas9分子和gRNA的至少一个复合物，所述gRNA具有与PD-L1基因的靶结构域互补的靶向结构域。在任意这些实施方式的一些中，遗传工程改造的T细胞包含特异性结合抗原的遗传工程改造的抗原受体；以及被破坏的编码PD-L1的基因，用于破坏PD-L1编码基因的物质，和/或对编码PD-L1的基因的破坏。在任意这些实施方式的一些中，基因的破坏是通过基因编辑核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、成簇规律间隔短回文核酸(CRISPR)/Cas9、和/或TAL效应物核酸酶(TALEN)介导的。在任意这些实施方式的一些中，破坏包括使基因的至少一个外显子的至少一部分缺失。在任意这些实施方式的一些中，破坏包括基因中的缺失、突变和/或插入，其导致基因中存在提早终止密码子；和/或破坏包括基因的第一或第二外显子内的缺失、突变、和/或插入。在任意这些实施方式的一些中，T细胞中PD-L1的表达，与在不存在抑制性核酸分子或基因破坏或不存在其活化的T细胞中的表达相比，降低至少50、60、70、80、90或95％。在任意这些实施方式的一些中，遗传工程改造的T细胞包含特异性结合抗原的遗传工程改造的抗原受体；以及编码这样的分子的多核苷酸，所述分子降低或破坏细胞中PD-1或PD-L1的表达，其中所述多核苷酸的表达或活性是条件型的。在任意这些实施方式的一些中，表达受到条件型启动子或增强子或反式激活因子的控制。在任意这些实施方式的一些中，条件型启动子或增强子或反式激活因子是诱导型启动子、增强子或反式激活因子或阻遏型启动子、增强子或反式激活因子。在任意这些实施方式的一些中，降低或破坏PD-1或PD-L1表达的分子是或包括或编码反义分子，siRNA，shRNA，miRNA，基因编辑核酸酶，锌指核酸酶蛋白(ZFN)，TAL效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR-Cas9组合的一种或多种组分，其特异性地结合、识别或杂交所述基因。在任意这些实施方式的一些中，启动子选自RNApolI、polII或polIII启动子。在任意这些实施方式的一些中，启动子选自：polIII启动子，其为U6或H1启动子；或polII启动子，其为CMV、SV40早期区或腺病毒主要晚期启动子。在任意这些实施方式的一些中，启动子是诱导型启动子。在任意这些实施方式的一些中，启动子包括Lac操纵子序列、四环素操纵子序列、半乳糖操纵子序列或多西环素操纵子序列，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程改造的T细胞，其包括：

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.29 US 62/168,721;2015.10.20 US 62/244,1321.一种工程改造的T细胞，其包括：(a)特异性结合抗原的遗传工程改造的抗原受体；和(b)抑制性核酸分子，其减少PD-L1的表达或能够造成PD-L1的表达的减少。2.如权利要求1所述的细胞，其中，所述抑制性核酸分子包括RNA干扰剂。3.如权利要求1或权利要求2所述的细胞，其中，所述抑制性核酸是或包括或编码小干扰RNA(siRNA)、微小RNA适应性shRNA、短发夹RNA(shRNA)、发夹siRNA、前体微小RNA(前-miRNA)或微小RNA(miRNA)。4.如权利要求1-3中任一项所述的细胞，其中，所述抑制性核酸分子包括与编码PD-L1的核酸互补的序列。5.如权利要求1所述的细胞，其中，所述抑制性核酸分子包括与编码PD-L1的核酸互补的反义寡核苷酸。6.一种遗传工程改造的T细胞，其包括：(a)特异性结合抗原的遗传工程改造的抗原受体；和(b)被破坏的编码PD-L1的基因，用于破坏编码PD-L1的基因的物质和/或对编码PD-L1的基因的破坏。7.如权利要求6所述的细胞，其中，所述基因的破坏是通过基因编辑核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、成簇规律间隔短回文核酸(CRISPR)/Cas9、和/或TAL效应物核酸酶(TALEN)介导的。8.如权利要求6或权利要求7所述的细胞，其中，所述破坏包括使所述基因的至少一个外显子的至少部分缺失。9.如权利要求6-8中任一项所述的细胞，其中：所述破坏包括所述基因中的缺失、突变和/或插入，其导致在所述基因中存在提早终止密码子；和/或所述破坏包括所述基因的第一或第二外显子内的缺失、突变和/或插入。10.如权利要求1-9中任一项所述的细胞，其中，与不存在所述物质或基因破坏或不存在所述T细胞活化条件下T细胞中的表达相比，T细胞中PD-L1的表达减少至少50、60、70、80、90或95％。11.一种遗传工程改造的T细胞，其包括：(a)特异性结合抗原的遗传工程改造的抗原受体；和(b)编码减少或破坏所述细胞中PD-1或PD-L1表达的一种或多种分子的多核苷酸，其中所述多核苷酸的活性或表达是条件型的。12.如权利要求11所述的细胞，其中，所述表达受到条件型启动子或增强子或反式激活因子的控制。13.如权利要求12所述的细胞，其中，所述条件型启动子或增强子或反式激活因子是诱导型启动子、增强子或反式激活因子或阻遏型启动子、增强子或反式激活因子。14.如权利要求11-13中任一项所述的遗传工程改造的T细胞，其中，减少或破坏PD-1或PD-L1表达的所述分子是或包括或编码反义分子，siRNA，shRNA，miRNA，基因编辑核酸酶，锌指核酸酶(ZFN)，TAL效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR-Cas9组合，其特异性地结合、识别或杂交所述基因。15.如权利要求12-14中任一项所述的细胞，其中，所述启动子选自RNApolI、polII或polIII启动子。16.如权利要求15所述的细胞，其中，所述启动子选自：polIII启动子，其为U6或H1启动子；或polII启动子，其为CMV、SV40早期区或腺病毒主要晚期启动子。17.如权利要求12-16中任一项所述的细胞，其中，所述启动子是诱导型启动子。18.如权利要求17所述的细胞，其中，所述启动子包括Lac操纵子序列、四环素操纵子序列、半乳糖操纵子序列或多西环素操纵子序列，或是其类似物。19.如权利要求12-16中任一项所述的细胞，其中，所述启动子是阻遏型启动子。20.如权利要求19所述的细胞，其中，所述启动子包括Lac阻遏型元件或四环素阻遏型元件，或是其类似物。21.如权利要求1-20中任一项所述的细胞，其中，所述T细胞是CD4+或CD8+T细胞。22.如权利要求1-21中任一项所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是功能性非T细胞受体。23.如权利要求1-22中任一项所述的细胞，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。24.如权利要求23所述的细胞，其中，所述CAR包括特异性结合所述抗原的胞外抗原识别结构域和包括ITAM的胞内信号转导结构域。25.如权利要求24所述的细胞，其中，所述胞内信号转导结构域包括CD3-ζ(CD3ζ)链的胞内结构域。26.如权利要求24或25所述的细胞，其中，所述CAR还包括共刺激信号转导区域。27.如权利要求26所述的细胞，其中，所述共刺激信号转导区域包括CD28或4-1BB的信号转导结构域。28.如权利要求26或权利要求27所述的细胞，其中，所述共刺激信号转导区域是CD28的信号转导结构域。29.如权利要求1-28中任一项所述的细胞，其是人细胞。30.如权利要求1-29中任一项所述的细胞，其是分离的细胞。31.一种核酸分子，其包括第一核酸和第二核酸，其中所述第一核酸任选地是第一表达盒，其编码抗原受体(CAR)，所述第二核酸任选地是第二表达盒，其编码针对PD-1或PD-L1的抑制性核酸分子。32.如权利要求31所述的核酸分子，其中，所述抑制性核酸分子包括RNA干扰剂。33.如权利要求31或权利要求32所述的核酸分子，其中，所述抑制性核酸分子是或包括或编码小干扰RNA(siRNA)、微小RNA适应性shRNA、短发夹RNA(shRNA)、发夹siRNA、前体微小RNA(前-miRNA)或微小RNA(miRNA)。34.如权利要求31-33中任一项所述的核酸分子，其中，所述抑制性核酸分子包括与编码PD-L1的核酸互补的序列。35.如权利要求31所述的核酸分子，其中，所述抑制性核酸分子包括与编码PD-L1的核酸互补的反义寡核苷酸。36.如权利要求31-35中任一项所述的核酸分子，其中，所述抗原受体是功能性非T细胞受体。37.如权利要求31-36中任一项所述的核酸分子，其中，所述遗传工程改造的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)。38.如权利要求37所述的核酸分子，其中，所述CAR包括特异性结合所述抗原的胞外抗原识别结构域和包括ITAM的胞内信号转导结构域。39.如权利要求38所述的核酸分子，其中，所述胞内信号转导结构域包括CD3-ζ(CD3ζ)链的胞内结构域。40.如权利要求38或39所述的核酸分子，其中，所述CAR还包括共刺激信号转导区域。41.如权利要求40所述的核酸分子，其中，所述共刺激信号转导区域包括CD28或4-1BB的信号转导结构域。42.如权利要求40或权利要求41所述的核酸分子，其中，所述共刺激信号转导区域是CD28的信号转导结构域。43.如权利要求31-42中任一项所述的核酸分子，其中，所述第一和第二核酸，任选地所述第一和第二表达盒，可操作地连接相同或不同的启动子。44.如权利要求31-43中任一项所述的核酸分子，其中，所述第一核酸，任选地第一表达盒，可操作地连接诱导型启动子或阻遏型启动子，并且所述第二核酸，任选地第二表达盒，可操作地连接组成型启动子。45.如权利要求31-44中任一项所述的核酸分子，其是分离的。46.一种载体，其包括权利要求31-45中任一项所述的核酸分子。47.如权利要求46所述的载体，其中，所述载体是质粒、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。48.如权利要求47所述的载体，其是整合酶缺陷型的。49.一种T细胞，其包括权利要求31-45中任一项所述的核酸分子或权利要求46-48中任一项所述的载体。50.如权利要求49所述的T细胞，其是CD4+或CD8+T细胞。51.如权利要求49或权利要求50所述的T细胞，其是人细胞。52.如权利要求49-51中任一项所述的T细胞，其是分离的。53.一种药物组合物，其包括如权利要求1-30或49-52中任一项所述的细胞和药学上可接受的运载体。54.一种产生遗传工程改造的T细胞的方法，包括：(a)将特异性结合抗原的遗传工程改造的抗原受体导入包括T细胞的细胞群；并且(b)将如下物质导入所述细胞群：相较于在一种或多种条件下孵育的没有导入所述物质的对应细胞群中T细胞中PD-L1的表达和/或上调，所述物质能够在经所述一种或多种条件孵育的群中的T细胞中导致PD-L1表达的减少和/或抑制PD-L1的上调。其中，步骤(a)和(b)同时或以任意顺序依次进行，从而将所述遗传工程改造的抗原受体和所述物质导入所述群中的T细胞。55.一种调节遗传工程改造的T细胞中PD-L1表达的方法，其包括，将如下物质导入T细胞：相较于经一种或多种条件下孵育的没有导入所述物质的对应T细胞中PD-L1的表达或上调，所述物质能够在经所述一种或多种条件孵育的所述细胞中导致PD-L1表达的减少和/或抑制PD-L1的上调，所述T细胞包括特异性结合抗原的遗传工程改造的抗原受体。56.如权利要求54或权利要求55所述的方法，其中，在具有抗原存在的条件下的孵育诱导所述对应群中PD-L1的表达或上调，所述对应群包括未导入所述物质的T细胞。57.如权利要求56所述的方法，其中，在抗原存在下的所述孵育包括在体外孵育所述细胞与所述抗原。58.如权利要求57所述的方法，其中，在抗原存在下的所述孵育进行：2小时至48小时，6小时至30小时或12小时至24小时，各自包括端值，或少于48小时，少于36小时或少于24小时。59.如权利要求56所述的方法，其中，所述孵育包括在条件下将所述细胞给予对象从而使得所述工程改造的抗原受体就所述孵育的至少部分而言特异性地结合所述抗原。60.如权利要求59所述的方法，其中，将细胞给予所述对象后24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天的时间内，所述孵育诱导表达或上调。61.如权利要求54-60中任一项所述的方法，其中，所述PD-L1表达的减少或对PD-L1上调的抑制是至少或至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。62.如权利要求54-61中任一项所述的方法，其是离体进行的。63.如权利要求54-62中任一项所述的方法，其中，所述物质的导入通过导入包括所述物质编码序列的核酸来进行。64.如权利要求54-63中任一项所述的方法，其中，所述导入包括诱导所述物质在所述T细胞中的瞬时表达，以使所述细胞中PD-L1表达临时减少或破坏，和/或其中所述减少或破坏不是永久的。65.如权利要求54-64中任一项所述的方法，其中，所述物质的活性或表达是条件型的。66.如权利要求65所述的方法，其中，所述表达受到条件型启动子或增强子或反式激活因子的控制。67.如权利要求66所述的方法，其中，所述条件型启动子或增强子或反式激活因子是诱导型启动子、增强子或反式激活因子或阻遏型启动子、增强子或反式激活因子。68.如权利要求66或权利要求67所述的方法，其中，所述启动子选自RNApolI、polII或polIII启动子。69.如权利要求68所述的方法，其中，所述启动子选自：polIII启动子，其为U6或H1启动子；或polII启动子，其为CMV、SV40早期区或腺病毒主要晚期启动子。70.如权利要求66-69中任一项所述的方法，其中，所述启动子是诱导型启动子。71.如权利要求70所述的方法，其中，所述启动子包括Lac操纵子序列、四环素操纵子序列、半乳糖操纵子序列或多西环素操纵子序列。72.如权利要求66-69中任一项所述的方法，其中，所述启动子是阻遏型启动子。73.如权利要求72所述的方法，其中，所述启动子包括Lac阻遏型元件或四环素阻遏型元件。74.如权利要求54-63中任一项所述的方法，其中，所述物质在所述T细胞中稳定表达，以造成所述细胞中PD-L1表达的持续的减少或破坏。75.如权利要求54-74中任一项所述的方法，其中，所述物质是包含在病毒载体中的核酸分子。76.如权利要求75所述的方法，其中，所述病毒载体是腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒或腺相关病毒载体。77.如权利要求54-76中任一项所述的方法，其中，所述物质是使所述细胞中PD-L1表达减少的抑制性核酸分子。78.如权利要求77所述的方法，其中，所述抑制性核酸分子包括RNA干扰剂。79.如权利要求77或权利要求78所述的方法，其中，所述抑制性核酸是或包括或编码小干扰RNA(siRNA)、微小RNA适应性shRNA、短发夹RNA(shRNA)、发夹siRNA、前体微小RNA(前-miRNA)或微小RNA(miRNA)。80.如权利要求78或权利要求79所述的方法，其中，所述抑制性核酸分子包括与编码PD-L1的核酸互补的序列。81.如权利要求77所述的方法，其中，所述抑制性核酸分子包括与编码PD-L1的核酸互补的反义寡核苷酸。82.如权利要求54-81中任一项所述的方法，其中，造成减少和/或抑制上调包括破坏编码PD-L1的基因。83.如权利要求82所述的方法，其中：所述破坏包括在DNA水平上破坏所述基因，和/或所述破坏是不可逆的；和/或所述破坏不是瞬时的。84.如权利要求82或83所述的方法，其中，所述破坏包括导入特异性结合或杂交所述基因的DNA结合蛋白或DNA-结合核酸。85.如权利要求84所述的方法，其中，所述破坏包括导入：(i)包括DNA-靶向蛋白和核酸酶的融合蛋白或(ii)RNA-引导的核酸酶。86.如权利要求85所述的方法，其中，所述DNA-靶向蛋白或RNA-引导的核酸酶包括锌指蛋白(ZFP)、TAL蛋白、或成簇规律间隔短回文核酸(CRISPR)，其对所述基因具有特异性。87.如权利要求82-86中任一项所述的方法，其中，所述破坏包括导入锌指核酸酶(ZFN)、TAL-效应子核酸酶(TALEN)、或CRISPR-Cas9组合，其特异性结合至、识别或杂交所述基因。88.如权利要求84-87中任一项所述的方法，其中，所述导入...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·厄德高，
申请(专利权)人：朱诺治疗学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US