基于纳米银催化银沉积的电化学核酸适配体传感器制造技术

本发明专利技术提供了基于纳米银催化银沉积的电化学核酸适配体传感器，用于对PDGF‑BB的测定。以酶标板为分析平台，印刷芯片电极为检测装置，构建电化学核酸适配体传感器。将生物素修饰的核酸适配体固定至链霉亲和素包裹的酶标板中，以巯基修饰的核酸适配体功能化的纳米银作为探针。通过三明治型的夹心反应后，加入银增强溶液，利用纳米银催化银沉积反应，在孔板中形成了大量的银沉积物。随着酸溶解生成的银沉积物后，插入印刷芯片电极，采用方波阳极溶出伏安法对释放出的银离子进行测定。银的电化学溶出峰与PDGF‑BB的浓度相关，从而实现对PDGF‑BB的定量测定。分析方法对PDGF‑BB的测定结果良好，线性范围为3.12 ng mL

【技术实现步骤摘要】
基于纳米银催化银沉积的电化学核酸适配体传感器
本专利技术属于生物检测和分析仪器
，具体涉及基于酶标板和印刷芯片电极，利用纳米银催化银沉积的反应，构建电化学核酸适配体传感器对血小板衍生生长因子BB（PDGF-BB）进行测定。
技术介绍
开发新的分析方法用于定性定量测定与疾病相关的蛋白质，在医学诊断、治疗和研究领域内至关重要。与抗体相比，核酸适配体具有化学稳定性强，合成简单，易于修饰的优点，同时适合于开发各种不同分析方法里的分子工具。因此，在研究者设计各种不同的生物分析方法里，核酸适配体成为了一种更为有效的选择。生物传感器是能够提供定量或半定量信息分析信息的分析仪器，它使用一个生物识别元件并直接与传导元件接触，在医疗诊断中获得了越来越多的关注。近年来，在生物传感器的构建中，核酸适配体被用做生物识别的元件，发展了多种不同的分析方法，例如荧光生物传感器、比色法生物传感器和电化学生物传感器等。同其他生物传感器相比较，电化学生物传感器具有灵敏度高，仪器设备简单和检测成本低的固有特点。将电化学检测的优点和核酸适配体特异性的识别能力结合起来并应用在传感器中，已经成为当前研究的重点。印刷芯片电极由于具有其他电极所没有的独特优点，具有成本低，灵敏度高、重现性好、可一次性使用的优点，为医学诊断提供一个崭新的分析平台。当前研究者们正致力于利用信号放大技术实现超灵敏，甚至单分子的生物检测。随着纳米技术的发展，基于纳米材料的信号放大技术有着检测过程迅速，易于实现微型化的优点，因此在实现高灵敏、高选择性的现场或在线测定生物分子领域内具有广阔的前景。在各种纳米材料标记物中，纳米银颗粒因为更容易氧化，因而具有更好的电化学性活性，从而更适合作为检测探针。目前基于银的检测方法主要被用于测定DNA，蛋白质和细胞活素的分析。各种不同银沉积方法被大量使用在超灵敏的电化学生物传感器中，比如化学还原法、酶催化银沉积法、电化学法、纳米颗粒标记催化银增强法等。PDGF-BB是血小板衍生生长因子三种异构体中的一种重要的蛋白质，通常在人恶性肿瘤中过表达，因此是一种关键的癌症生物标志物。由于PDGF-BB有两个活性点位能够和相应的核酸适配体结合，因此多种电化学核酸适配体生物传感器被开发用以灵敏的检测PDGF-BB。酶标板是由光学透明的聚苯乙烯制作的，用于ELISA分析方法，对抗原、抗体或抗原抗体复合物的吸附起着重要作用。除传统的免疫方法以外，酶标板也可成为核酸适配体的固定载体，对生物标志物进行定量分析。
技术实现思路
本专利技术克服现有技术不足，提出了一种基于纳米银催化银沉积的电化学核酸适配体传感器，实现对PDGF-BB的测定。为实现本专利技术的上述目的，本专利技术采用如下技术方案：以酶标板为分析平台，印刷芯片电极为检测装置，构建电化学核酸适配体传感器。将生物素修饰的核酸适配体固定至链霉亲和素包裹的酶标板中，以巯基修饰的核酸适配体功能化的纳米银作为探针。通过三明治型的夹心反应后，加入银增强溶液，利用纳米银催化效应，在孔板中形成大量的银沉积物。随着酸溶解生成的银沉积物后，将印刷芯片电极插入相应板孔中，采用方波阳极溶出伏安法对释放出的银离子进行测定。银的电化学溶出峰与PDGF-BB的浓度相关，从而实现对PDGF-BB的定量测定。所述酶标板为市售96孔板。所述印刷芯片电极制作方法如下:根据设计的电极结构图，采用PP合成纸作为基底，在丝网印刷机器上印制各层浆料。依次印制导电银层、导电碳层、银/氯化银层和绝缘层。每层浆料印刷后均需在125℃下烘干固化2小时。所制备的印刷芯片电极在使用前，在PBS缓冲溶液中于+1.5V的电位下氧化处理2分钟。所述生物素修饰的核酸适配体序列为：5’-AAAAAAAATACTCAGGGCACTTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTAT，其5’端由生物素修饰。所述生物素修饰的核酸适配体在酶标板中的固定方法如下：用碳酸钠缓冲溶液（pH=9.6）溶解链霉亲和素，加入到酶标板中，4℃孵育并静置过夜。各孔用无蛋白封闭缓冲溶液温育1小时以消除非特异性的吸附，随后往各孔中加入上述生物素修饰的核酸适配体溶液，37℃下反应1小时后用PBST缓冲溶液清洗。所述巯基修饰的核酸适配体的序列如下：5’AAAAAAAATACTCAGGGCACTTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTAT，其5’端由巯基修饰。所述巯基修饰的核酸适配体功能化的纳米银制备方法如下：在搅拌的状态下将硝酸银和硼氢化钠混匀，持续搅拌直至恢复至室温。将巯基适配体与所合成的纳米银混合。将上述溶液用盐溶液进行陈化，分次加入NaCl直至浓度为0.2M。孵育42小时候后，用PBS缓冲溶液离心洗涤后于4℃下保存。所述三明治型的夹心反应如下：在上述物素修饰的核酸适配体在酶标板中的固定后，于各反应孔中加入不同浓度的PDGF-BB，37℃下反应1小时后用PBST缓冲溶液，以去除未结合的PDGF-BB。最后在各孔里添加上述巯基修饰的核酸适配体功能化的纳米银，37℃下反应1小时，在孔中形成了生物素修饰的核酸适配体，PDGF-BB，巯基修饰的核酸适配体功能化的纳米银这三者之间的三明治型的复合物，各孔用PBST缓冲溶液洗涤。所述银增强溶液为硝酸银和抗坏血酸。所述银沉积物的形成过程如下：将银增强溶液加入上述三明治型的夹心反应后的各孔中，并在暗处避光放置10分钟。银沉积反应完成后，用水清洗各孔三次。所述PDGF-BB定量测定的过程如下：在上述银沉积物形成后的各孔中加入HNO3，于室温下溶解所生成的银沉积物。往各孔里加入KNO3，混匀后将印刷芯片电极插入孔中，并连接电化学工作站，用方波阳极溶出伏安法测定溶液中的银离子。电极在－0.5V下，富集10分钟后在－0.4V至+0.4V范围内进行方波伏安扫描，记录峰电流。峰电流的浓度的对数与PDGF-BB的浓度线性相关，从而实现定量测定。本专利技术的有益效果：本专利技术提出了一种基于纳米银催化银沉积的电化学核酸适配体传感器，对血小板衍生生长因子BB（PDGF-BB）进行测定。将纳米银催化银沉积和高灵敏的电化学溶出伏安法结合，形成了所设计的传感器的信号，实现了对目标蛋白质PDGF-BB的测定。在优化的实验条件下，传感器对PDGF-BB的测定结果良好，线性范围为3.12ngmL-1—200ngmL-1，检测限为1.23ngmL-1。所开发的传感器可用于临床医学中特异性、高灵敏的PDGF-BB的检测。附图说明图1基于纳米银催化银沉积的电化学核酸适配体传感器示意图。图2传感器检测装置示意图。图3印刷芯片电极的设计图。图4传感器测定PDGF-BB的方波溶出伏安曲线图（A）和标准曲线图（B）。图5传感器的特异性结果图。具体实施方式为了更好地理解本专利技术，下面用具体实例来详细说明本专利技术的技术方案，但是本专利技术并不局限于此。以下实施例所需试剂和材料如下：链霉亲和素（北京博奥生物有限公司）；PDGF-BB（MW=24800Da，R&DSystem，Minneapolis）；牛血清白蛋白，硝酸银，硼氢化钠,，吐温（Tween-20），KCl，MgCl2，抗坏血酸（Sigma-Aldrich，美国）。导电银浆（十条公司，日本），导电碳浆（Acheson公司，美国）；银本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于纳米银催化银沉积的电化学核酸适配体传感器，用于对PDGF‑BB的测定，其特征在于：以酶标板为分析平台，印刷芯片电极为检测装置，构建电化学核酸适配体传感器；将生物素修饰的核酸适配体固定至链霉亲和素包裹的酶标板中，以巯基修饰的核酸适配体功能化的纳米银作为探针；通过三明治型的夹心反应后，加入银增强溶液，利用纳米银催化银沉积反应，在孔板中形成了大量的银沉积物；随着酸溶解生成的银沉积物后，插入印刷芯片电极，采用方波阳极溶出伏安法对释放出的银离子进行测定；银的电化学溶出峰与PDGF‑BB的浓度相关，从而对PDGF‑BB定量测定。

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米银催化银沉积的电化学核酸适配体传感器，用于对PDGF-BB的测定，其特征在于：以酶标板为分析平台，印刷芯片电极为检测装置，构建电化学核酸适配体传感器；将生物素修饰的核酸适配体固定至链霉亲和素包裹的酶标板中，以巯基修饰的核酸适配体功能化的纳米银作为探针；通过三明治型的夹心反应后，加入银增强溶液，利用纳米银催化银沉积反应，在孔板中形成了大量的银沉积物；随着酸溶解生成的银沉积物后，插入印刷芯片电极，采用方波阳极溶出伏安法对释放出的银离子进行测定；银的电化学溶出峰与PDGF-BB的浓度相关，从而对PDGF-BB定量测定。2.如权利要求1所述的电化学核酸适配体传感器，其特征在于：印刷芯片电极与酶标板联用，进行电化学测定。3.如权利要求1所述的印刷芯片电极，其特征在于：根据设计的电极结构图，采...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋伟，朱超云，赖庆菁，
申请(专利权)人：南京科技职业学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32