微生物对肠道菌群的影响的评估方法及具有稳定的肠道菌群的动物模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种微生物对肠道菌群的影响的评估方法及具有稳定的肠道菌群的动物模型的构建方法。该评估方法包括：构建具有稳定的肠道菌群的动物模型；给两组动物模型分别饲喂含有待测微生物的无菌饲料及不含待测微生物的无菌饲料，收集饲喂后两组动物模型的粪便得到第一粪便及第二粪便，测定并比较第一粪便及第二粪便中肠道菌群的含量；若第一粪便中双歧杆菌及乳杆菌的含量的对数之和与肠杆菌及肠球菌的含量的对数之和的比值大于第二粪便中双歧杆菌及乳杆菌的含量的对数之和与肠杆菌及肠球菌的含量的对数之和的比值，则待测微生物对肠道菌群有促进作用。上述评估方法能够真实且较为准确地评估微生物对肠道菌群的影响。

Evaluation method of microorganism influence on intestinal flora and construction method of animal model with stable intestinal flora

The invention relates to a method for evaluating the influence of microorganisms on intestinal flora and a method for constructing an animal model with stable intestinal flora. The evaluation methods include: building an animal model with stable intestinal flora; feeding two groups of animal models to aseptic feed containing untested microorganisms and aseptic feed that do not contain microbe. After feeding, the feces of the two animal models were collected to get the first feces and the two faeces, and the first stool and the first faeces were compared and the first faeces were compared. Two the content of the intestinal flora in the feces; the ratio of logarithmic ratio of the logarithmic of the content of Bifidobacterium and Lactobacillus in the first stool with the logarithmic sum of enterobacteria and Enterococcus is greater than the logarithmic of the content of Bifidobacterium and Lactobacillus in second stool and the sum of the logarithmic sum of enterobacteria and Enterococcus, the ratio of the logarithmic ratio of Enterobacteriaceae and Enterococcus to be measured. Microbes can promote intestinal microflora. The above methods can be used to assess the impact of microbes on intestinal flora accurately and accurately.

【技术实现步骤摘要】
微生物对肠道菌群的影响的评估方法及具有稳定的肠道菌群的动物模型的构建方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种微生物对肠道菌群的影响的评估方法及具有稳定的肠道菌群的动物模型的构建方法。
技术介绍
肠道菌群对生物体的生理、免疫、营养及消化等方面均起着至关重要的作用。肠道菌群包括有益菌群和有害菌群，其中，有益菌能够合成多种生物体生长发育所必需的维生素，参与糖类和蛋白质的代谢，促进铁、镁及锌等矿物元素的吸收。在正常情况下，生物体肠道内的有益菌和有害菌处于相对平衡的状态。一旦肠道菌群失去平衡，有害菌占优势时，有害菌能够将摄入的营养物质转化成有害的物质，进而对生物体产生不良的影响。一些研究通过使生物体摄入一些有益微生物来维持肠道菌群的平衡。目前，对于这些微生物对肠道菌群的影响的评价，主要是利用反应器模拟肠道环境，向反应器中添加微生物并培养，以检测这些微生物对肠道菌群的影响，但是这种方式不能真实地反映微生物在动物肠道中对肠道菌群的影响，得到的结果准确性较差。
技术实现思路
基于此，有必提供一种能够真实且较为准确地评估微生物对肠道菌群的影响的评估方法。此外，提供一种具有稳定的肠道菌群的动物模型的构建方法。一种微生物对肠道菌群的影响的评估方法，包括如下步骤：给无菌动物饲喂粪便悬液，使得所述无菌动物的肠道内达到稳态，得到动物模型；分别饲喂第一组动物模型和第二组动物模型，其中，给所述第一组动物模型饲喂无菌饲料，给所述第二组动物模型饲喂含有待测微生物的无菌饲料，所述含有待测微生物的无菌饲料中的所述待测微生物的添加量为105cfu/g～107cfu/g，收集饲喂后所述第一组动物模型的粪便得到第一粪便，收集饲喂后所述第二组动物模型的粪便得到第二粪便；及通过实时荧光定量PCR分别检测所述第一粪便和所述第二粪便中肠道菌群的含量，所述肠道菌群包括双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌和肠球菌，若则所述待测微生物对所述肠道菌群具有促进作用，其中，a'表示所述第一粪便中所述双歧杆菌的含量，b'表示所述第一粪便中所述乳杆菌的含量，c'表示所述第一粪便中所述肠杆菌的含量，d'表示所述第一粪便中所述肠球菌的含量，a表示所述第二粪便中所述双歧杆菌的含量，b表示所述第二粪便中所述乳杆菌的含量，c表示所述第二粪便中所述肠杆菌的含量，d表示所述第二粪便中所述肠球菌的含量。上述评估方法通过给无菌动物饲喂粪便悬液，能够得到肠道内达到稳态的动物模型，该动物模型中除了粪便悬液中的菌群，不含有其他任何外源的菌，能够保证评价微生物对肠道菌群的影响的准确性。由于通过给两组动物模型饲喂分别饲喂无菌饲料和含有待测微生物的无菌饲料，并收集饲喂后动物模型的粪便，得到第一粪便和第二粪便，使得第一粪便和第二粪便中的肠道菌群的分布更接近于生物体的肠道菌群的分布，能够更加真实地反应微生物对肠道菌群的影响。又由于通过实时荧光定量PCR检测粪便中肠道菌群的含量，使得检测结果更加准确。同时，通过将第一粪便中双歧杆菌及乳杆菌的含量的对数之和与肠杆菌及肠球菌的含量的对数之和的比值与第二粪便中双歧杆菌及乳杆菌的含量的对数之和与肠杆菌及肠球菌的含量的对数之和的比值之间的差异作为待测微生物对肠道菌群的影响的评价指标，能够更加准确的反映肠道菌群的变化，进而更加准确地反映待测微生物对肠道菌群的影响。经试验验证，通过上述评估方法对双歧杆菌、乳酸菌、嗜酸杆菌、丁酸梭菌及产气荚膜梭菌对肠道菌群的影响进行评估，结果显示双歧杆菌、乳酸菌、嗜酸杆菌及丁酸梭菌均对肠道菌群有促进作用，产气荚膜梭菌不利于肠道菌群的稳定，导致肠杆菌和肠球菌的大量增值，同时，上述评估方法得到的双歧杆菌对肠道菌群的影响的趋势与在反应器模拟培养得到的双歧杆菌对肠道菌群的影响的趋势是一致，说明上述评估方法能够真实且较为准确地评估微生物对肠道菌群的影响。在其中一个实施例中，所述给无菌动物饲喂粪便悬液，使得所述无菌动物的肠道内达到稳态的操作具体如下：在无菌环境中，给所述无菌动物饲喂所述粪便悬液，饲喂14天～21天，得到所述动物模型，其中，所述粪便悬液的浓度为0.2g/mL～0.5g/mL，所述粪便悬液的饲喂量为每kg所述无菌动物每次饲喂0.3mL～0.5mL的所述粪便悬液。在其中一个实施例中，所述无菌环境的温度为20℃～24℃，湿度为40％～70％。在其中一个实施例中，所述粪便为猪的粪便或人的粪便，所述无菌动物为无菌小鼠或无菌大鼠。在其中一个实施例中，所述给所述第二组动物模型喂含有待测微生物的无菌饲料的操作中，每kg所述第二组动物模型每次饲喂2g～5g的含有所述待测微生物的无菌饲料，饲喂的频率为1次/天～2次/天，饲喂的时间至少为7天。在其中一个实施例中，所述无菌饲料包括小麦、奶粉、豆粕、植物油、维生素、酵母、磷酸氢钙及柠檬酸，所述小麦、所述奶粉、所述豆粕、所述植物油、所述维生素、所述酵母、所述磷酸氢钙及所述柠檬酸的质量比为51：19.5：11：9.75：0.001：2.5：0.5：0.001～52：20.5：12：10.75：0.1：4.5：1.5：0.525。在其中一个实施例中，所述通过实时荧光定量PCR分别检测所述第一粪便和所述第二粪便中肠道菌群的含量的操作具体如下：分别提取所述第一粪便和所述第二粪便中肠道菌群的基因组DNA，将所述基因组DNA分别与其中一种所述肠道菌群的正向引物、反向引物混合进行实时荧光定量PCR扩增反应，所述肠道菌群包括双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌和肠球菌；及分别获取所述第一粪便和所述第二粪便中每一种所述肠道菌群实时荧光定量PCR扩增反应的CT值，将所述CT值带入相应的细菌标准品建立的标准曲线中，得到所述第一粪便和所述第二粪便中的每一种所述肠道菌群的含量。在其中一个实施例中，所述双歧杆菌的正向引物的碱基序列如SEQIDNo.1所示，所述双歧杆菌的反向引物的碱基序列如SEQIDNo.2所示；及/或，所述乳杆菌的正向引物的碱基序列如SEQIDNo.3所示，所述乳杆菌的反向引物的碱基序列如SEQIDNo.4所示；及/或，所述肠杆菌的正向引物的碱基序列如SEQIDNo.5所示，所述肠杆菌的反向引物的碱基序列如SEQIDNo.6所示；及/或，所述肠球菌的正向引物的碱基序列如SEQIDNo.7所示，所述肠球菌的反向引物的碱基序列如SEQIDNo.8所示。在其中一个实施例中，所述待测微生物为双歧杆菌、乳酸菌、嗜酸杆菌或丁酸梭菌。一种具有稳定的肠道菌群的动物模型的构建方法，包括以下步骤：给无菌动物饲喂粪便悬液，以使所述无菌动物的肠道内具有稳定的肠道菌群，得到所述动物模型；其中，所述粪便悬液的浓度为0.2g/mL～0.5g/mL，所述粪便悬液的饲喂量为每kg所述无菌动物每次饲喂0.3mL～0.5mL的所述粪便悬液。。附图说明图1为不同稀释倍数的双歧杆菌的PCR扩增后的溶解曲线；图2为不同稀释倍数的乳杆菌的PCR扩增后的溶解曲线；图3为不同稀释倍数的肠杆菌的PCR扩增后的溶解曲线；图4为不同稀释倍数的肠球菌的PCR扩增后的溶解曲线；图5为以双歧杆菌的DNA浓度的对数为横坐标，PCR扩增反应对应的CT为纵坐标绘制的标准曲线；图6为以乳杆菌的DNA浓度的对数为横坐标，PCR扩增反应对应的CT为纵坐标绘制的标准曲线；图7为以肠杆菌的DNA浓度的对数为横本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微生物对肠道菌群的影响的评估方法，其特征在于，包括如下步骤：给无菌动物饲喂粪便悬液，使得所述无菌动物的肠道内达到稳态，得到动物模型；分别饲喂第一组动物模型和第二组动物模型，其中，给所述第一组动物模型饲喂无菌饲料，给所述第二组动物模型饲喂含有待测微生物的无菌饲料，所述含有待测微生物的无菌饲料中的所述待测微生物的添加量为10

【技术特征摘要】
1.一种微生物对肠道菌群的影响的评估方法，其特征在于，包括如下步骤：给无菌动物饲喂粪便悬液，使得所述无菌动物的肠道内达到稳态，得到动物模型；分别饲喂第一组动物模型和第二组动物模型，其中，给所述第一组动物模型饲喂无菌饲料，给所述第二组动物模型饲喂含有待测微生物的无菌饲料，所述含有待测微生物的无菌饲料中的所述待测微生物的添加量为105cfu/g～107cfu/g，收集饲喂后所述第一组动物模型的粪便得到第一粪便，收集饲喂后所述第二组动物模型的粪便得到第二粪便；及通过实时荧光定量PCR分别检测所述第一粪便和所述第二粪便中肠道菌群的含量，所述肠道菌群包括双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌和肠球菌，若则所述待测微生物对所述肠道菌群具有促进作用，其中，a'表示所述第一粪便中所述双歧杆菌的含量，b'表示所述第一粪便中所述乳杆菌的含量，c'表示所述第一粪便中所述肠杆菌的含量，d'表示所述第一粪便中所述肠球菌的含量，a表示所述第二粪便中所述双歧杆菌的含量，b表示所述第二粪便中所述乳杆菌的含量，c表示所述第二粪便中所述肠杆菌的含量，d表示所述第二粪便中所述肠球菌的含量。2.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于，所述给无菌动物饲喂粪便悬液，使得所述无菌动物的肠道内达到稳态的操作具体如下：在无菌环境中，给所述无菌动物饲喂所述粪便悬液，饲喂14天～21天，得到所述动物模型，其中，所述粪便悬液的浓度为0.2g/mL～0.5g/mL，所述粪便悬液的饲喂量为每kg所述无菌动物每次饲喂0.3mL～0.5mL的所述粪便悬液。3.根据权利要求2所述的评估方法，其特征在于，所述无菌环境的温度为20℃～24℃，湿度为40％～70％。4.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于，所述粪便为猪的粪便或人的粪便，所述无菌动物为无菌小鼠或无菌大鼠。5.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于，所述给所述第二组动物模型喂含有待测微生物的无菌饲料的操作中，每kg所述第二组动物模型每次饲喂2g～5g的含有所述待测微生物的无菌饲料，饲喂的频率为1次/天～2次/天，饲喂的时间至少为7天。6.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于，所述无菌饲料包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：向永生，魏泓，刘建华，王玲玲，
申请(专利权)人：深圳市百澳飞生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44