检测胃肿瘤制造技术

本发明专利技术提供了一种检测肿瘤的技术，特别是用于检测类似胃癌等癌前和恶性肿瘤的方法、组合物和相关用途，但不仅局限于此。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测胃肿瘤相关申请的交互参照本申请是2016年8月31日提交的美国临时申请No.62/212,221申请的优先权，其全部内容被纳入此处作为参考。
本专利技术提供了一种检测肿瘤的技术，特别是用于检测胃癌等癌前和恶性肿瘤的方法、组合物和相关用途，但并不局限于此。专利技术背景胃癌是世界上第三大最常见的癌症死亡原因(例如参照世界卫生组织的癌症信息发布文件No297.WHO)，而且在西方国家仍然很难治愈，主要是因为大多数患者都患具晚期疾病。在美国，胃恶性肿瘤是目前最常见的第十五种癌症(例如参照国家癌症研究所的监测、流行病学和最终结果SEERStat信息发布文件：胃癌)。然而，在大多数发达国家，胃癌发病率在过去半个世纪中急剧下降。胃癌减少的原因是由于广泛使用制冷，其产生了若干有益的影响：增加了新鲜水果和蔬菜的消费量；减少了食盐的摄入量，盐被用作食品防腐剂；以及减少了因未冷藏肉类产品腐烂而产生的致癌化合物对食品的污染。食盐和盐类食物可能会破坏胃粘膜，导致炎症，以及相关的DNA合成和细胞增殖的增加。其他可能导致胃癌发病率下降的因素包括：由于卫生条件和抗生素使用的改善，慢性幽门螺杆菌感染率降低，以及一些国家加强了筛查(例如参照美国癌症协会的“全球癌症事实&数据显示”3rded.)。然而，在西方国家，胃癌仍然很难治愈，这主要是因为大多数患者都患有晚期疾病。即使是处于最有利状态的患者，也经常死于复发性疾病。因此，需要改进胃癌的早期检测方法和技术。
技术实现思路
甲基化DNA作为一种潜在的生物标记，在大多数肿瘤类型的组织中得到了广泛的研究。在许多情况下，DNA甲基转移酶在胞嘧啶-磷酸盐-鸟嘌呤(CpG)胰岛位点向DNA中添加甲基，作为基因表达的外遗传控制。在具有生物吸引的机制中，肿瘤抑制基因启动子区获得的甲基化事件可被认为沉默基因表达，从而促使肿瘤发生。DNA甲基化可能是一种比RNA或蛋白质表达更具化学和生物稳定性的诊断工具(Laird(2010)“全基因组DNA甲基化分析的原则和挑战”NatRevGenet11:191–203)。此外，在散发性结肠癌等其他癌症中，甲基化标记比单个DNA突变具有更好的特异性和更广泛的信息性和敏感性(Zou等人(2007)“结直肠肿瘤中的高度甲基化基因：用于筛查的暗示”癌症流行病学生物标记Prev16:2686–96)。对CpG胰岛的分析在应用于动物模型和人类细胞系时已经取得了重要的结果。例如，Zhang和他的同事发现，来自同一CpG胰岛的不同部分的扩增产物可能存在不同程度的甲基化(Zhang等人(2009)“单碱基对和单等位基因解析的21号染色体基因启动子的DNA甲基化分析”PLoSGenet5:e1000438)。此外，甲基化水平在高度甲基化序列和非甲基化序列之间呈双模式分布，进一步支持DNA甲基转移酶活性的二进制转换图案(Zhang等人(2009)“单碱基对和单等位基因解析的21号染色体基因启动子的DNA甲基化分析”PLoSGenet5:e1000438)。对小鼠体内和体外细胞系的分析表明，只有约0.3％的高CpG密度启动子(HCP，定义为在300个碱基对区域有>7％CpG序列)被甲基化，其中低CpG密度区域(定义为在300个碱基对区域内具有<5％CpG序列)往往以动态组织特异性图案被频繁地甲基化(Meissner等人(2008)“多能和分化细胞的基因组尺度DNA甲基化图谱”Nature454:766–70)。HCPs包括普遍存在的管家基因的启动子和高度调控的发育基因。在>50％甲基化的HCP位点中，有几个已建立的标记，如Wnt2,NDRG2,SFRP2和BMP3(Meissner等人(2008)“多能和分化细胞的基因组尺度DNA甲基化图谱”Nature454:766–70)。总的来说，胃肠道癌症占癌症死亡率比任何其他器官系统都高。然而，目前只有结直肠癌在国内进行筛查。美国每年死于上消化道癌的死亡率超过90000，而结直肠癌的死亡率约为50000。胃腺癌是全世界第二常见的癌症死亡原因，每年有近一百万人死亡。在太平洋、亚洲、俄罗斯和拉丁美洲的一些地区最为普遍。由于大多数患者具晚期疾病，因此预后较差(5年生存率<5-15％)。胃癌的基因组机制是复杂和不完全了解的。幽门螺杆菌感染引起的慢性胃炎与环境暴露有关。染色体和小随体不稳定是与胃癌和表观遗传改变有关。在24％～47％的病例中也描述了CpG甲基化表型.。通常被观察到的突变包括基因p53,APC,β-连环蛋白,和k-ras，但这些相对罕见，且具异质性。胃癌会使细胞和DNA散布至消化道，最终在大便中排出。以前曾用高敏感性化验来检测胃癌患者粪便中的突变DNA，这些患者的切除肿瘤已知含有相同的序列。然而，突变标记的一些限制与检测的潜在异质性和笨拙过程有关；通常，必须对多个基因的每个突变位点进行单独化验，才能获得高敏感性。DNA甲基转移酶活性的胞嘧啶-磷酸盐-鸟嘌呤(CpG)胰岛位点的表观基因甲基化已被认为是大多数肿瘤组织中潜在的一类生物标记。在具有生物吸引的机制中，肿瘤抑制基因启动子区获得的甲基化事件可被认为沉默基因表达，从而促使肿瘤发生。DNA甲基化可能是一种比RNA或蛋白质表达更具化学和生物稳定性的诊断工具。此外，在散发性结肠癌等其他癌症中，异常甲基化标记比单个DNA突变具有更广泛的信息性和敏感性并具有更好的特异性。一些方法可用于寻找新的甲基化标记。虽然微阵列的CpG甲基化是一种合理的、高通量的方法，但这种策略偏向于已知的感兴趣区域，主要建立的肿瘤抑制基因启动子。在过去的十年里，DNA甲基化的全基因组分析的替代方法已经开发出来。有三种基本方法。第一种方法是利用DNA限制酶切来识别特定的甲基化位点，然后是几种可能的分析技术，这些技术提供的甲基化数据仅限于酶识别位点或以量化步骤扩增DNA的引物(如甲基化特异性PCR；MSP)。第二种方法是利用定向于甲基胞嘧啶或其他甲基化特异性结合域的抗体来丰富基因组DNA的甲基化部分，然后进行微阵列分析或测序，将片段映射到参考基因组。这种方法不提供片段中所有甲基化位点的单核苷酸解析。第三种方法从DNA的重亚硫酸盐处理开始，将所有未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，然后在耦合到适配体后限制酶切以及对所有片段进行完全测序。选择限制酶可以丰富CpG稠密区的片段，减少分析过程中可能映射到多个基因体位的冗余序列数。后一种方法称为减少代表性重亚硫酸盐序列(RRBS)，但据了解尚未用于胃癌的研究。RRBS在80～90％的CpG胰岛和大多数中到高解读覆盖率的肿瘤抑制启动子的单核苷酸解析下产生CpG甲基化状态数据。在癌症病例对照研究中，对这些数据进行分析，可以识别差异甲基化区域(DMRs)。在先前对胰腺癌样本的RBS分析中，发现了数百例DMRs，其中一些从未与癌变相关，且其中一些未加标注。对于独立组织样本集的进一步有效性研究证实了标记CpGs在性能上具100％敏感性和特异性。高鉴别标记的临床应用可能会产生很大影响。例如，在诸如粪便或血液等远隔介质中的标记化验，可以为胃肿瘤的检测提供准确的筛查或诊断工具。在开发本技术实施例的过程中所进行的实验列出并描述从胃癌样本以类似方式本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于表征人类患者的样本的方法，包括：(a)从人类患者的样本中获取DNA；(b)化验DNA甲基化标记的甲基化状态，所述标记包括从表1、2、4或7的DMR 1‑274构成组中选出的差异甲基化区域DMR中的碱基；(c)将所述化验的一个或多个DNA甲基化标记的甲基化状态与无胃肿瘤的人类患者的一个或多个DNA甲基化标记的甲基化水平参考值进行比较。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.31 US 62/212,2211.一种用于表征人类患者的样本的方法，包括：(a)从人类患者的样本中获取DNA；(b)化验DNA甲基化标记的甲基化状态，所述标记包括从表1、2、4或7的DMR1-274构成组中选出的差异甲基化区域DMR中的碱基；(c)将所述化验的一个或多个DNA甲基化标记的甲基化状态与无胃肿瘤的人类患者的一个或多个DNA甲基化标记的甲基化水平参考值进行比较。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本是粪便样本、组织样本、胃组织样本、血浆样本或尿液样本。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本是胃组织样本，且所述DMR选自DMRNos.253,251,254,255,256,249,257,258,259,260,261,262,250,263,1,264,265,196,266,118,267,268,269,270,271,272,46,273,252及237；或其中，所述样本是血浆样本，且所述DMR选自：DMRNos.253,237,252,261,251,196,250,265,256,249及274。4.根据权利要求1所述的方法，包括化验多个DNA甲基化标记。5.根据权利要求1所述的方法，包括化验2-11个DNA甲基化标记。6.根据权利要求1所述的方法，包括化验12-107个DNA甲基化标记。7.根据权利要求1所述的方法，其中，化验所述样本中的所述一个或多个DNA甲基化标记的所述甲基化状态，包括确定一个碱基的所述甲基化状态。8.根据权利要求1所述的方法，其中，化验所述样本中的所述一个或多个DNA甲基化标记的所述甲基化状态，包括确定多个碱基的甲基化程度。9.根据权利要求1所述的方法，包括化验正向链的甲基化状态或化验反向链的甲基化状态。10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA甲基化标记是100个或更少碱基的区域。11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA甲基化标记是500个或更少碱基的区域。12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA甲基化标记是1000个或更少碱基的区域。13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA甲基化标记是5000个或更少碱基的区域。14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA甲基化标记是一个碱基。15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNA甲基化标记位于高CpG密度启动子中。16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述化验包括使用甲基化特异性聚合酶链式反应、核酸测序、质谱、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离或目标捕获。17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述化验包括使用甲基化特异性寡核苷酸。18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述样本是组织样本，且所述甲基化特异性寡核苷酸从SEQIDNO:1–70构成的组中被选出；或其中，所述样本是血浆样本，且所述甲基化特异性寡核苷酸从SEQIDNO:71-109构成的组中被选出。19.根据权利要求1所述的方法，其中，具有从ARHGEF4,ELMO1,ABCB1,CLEC11A,ST8SIA1,SFMBT2,CD1D,CYP26C1,ZNF569及C13ORF18构成的组中选出的标注的染色体区域包括所述DNA甲基化标记。20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DMR来自表4，并从DMRNo.49,43,196,66,1,237,249,250,251及252构成的组中被选出。21.根据权利要求1所述的方法，其中，具有从ELMO1,ARHGEF4,EMX1,SP9,CLEC11A,ST8SIA1,BMP3,KCNA3,DMRTA2,KCNK12,CD1D,PRKCB,CYP26C1,ZNF568,ABCB1,ELOVL2,PKIA,SFMBT2(893),PCBP3,MATK,GRN2D,NDRG4,DLX4,PPP2R5C,FGF14,ZNF132,CHST2(7890),FLI1,c13orf18及ZNF569构成的组中选出的标注的染色体区域包括所述DNA甲基化标记。22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DMR选自表2并从DMRNo.253,251,254,255,256,249,257,258,259,260,261,262,250,263,1,264,265,196,266,118,267,268,269,270,271,272,46,273,252及237构成的组中被选出。23.根据权利要求1所述的方法，其中，具有从ELMO1,ZNF569,C13orf18,CD1D,ARHGEF4,SFMBT2,PPP25RC,CYP26C1,PKIA,CLEC11A,LRRC4及ST8SIA1构成的组中选出的标注的染色体区域包括所述DNA甲基化标记，其中，所述样本是血浆样本。24.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DMR来自表4和表7，并从DMRNo.253,237,252,261,251,196,250,265,256,249及274构成的组中被选出，其中，所述样本是血浆样本。25.一种用于表征从人类患者获得的样本的方法，所述方法包括：(a)确定所述样本中的DNA甲基化标记的甲基化状态，所述样本包括：从表1,2,4和7中的DMR1–274组成的DMR中的一个碱基；(b)将所述患者样本中的所述DNA甲基化标记物的所述甲基化状态与无胃癌的人类对象的正常对照样本中的所述DNA甲基化标记的甲基化状态进行比较；(c)确定所述人类患者和所述正常对照样本中的所述甲基化状态中的置信区间和/或p值差异。26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述置信区间为90％,95％,97.5％,98％,99％,99.5％,99.9％或99.99％且所述p值为0.1,0.05,0.025,0.02,0.01,0.005,0.001,或0.0001。27.一种用于表征从人类对象获得的样本的方法，所述方法包括：将含有DMR的核酸与重亚硫酸盐试剂反应，生成重亚硫酸盐反应核酸；将所述重亚硫酸盐反应核酸测序，提供所述重亚硫酸盐反应核酸的核苷酸序列；将所述重亚硫酸盐反应核酸的所述核苷酸序列与含有无胃癌的对象的所述DMR的核酸的核苷酸序列进行比较，来鉴别两个所述序列中的差异。28.一种用于表征从人类对象获得的样本的系统，所述系统包括：分析元件，被配置来确定样本的甲基化状态；软件元件，被配置来将所述样本的所述甲基化状态与记录在数据库中的对照样本或参考样本的甲基化状态进行比较；警报元件，被配置来基于甲基化状态的组合确定单个值，并告知用户有关胃癌的甲基化状态。29.根据权利要求28所述的系统，其中，所述样本包括：含有DMR的核酸。30.根据权利要求28所述的系统，进一步包括用于分离核酸的元件。31.根据权利要求28所述的系统，进一步包括用于收集样本的元件。32.根据权利要求28所述的系统，其中，所述样本是粪便样本、组织样本、胃组织样本、血浆样本或尿液样本。33.根据权利要求28所述的系统，其中，所述数据库包括：含有DMR的核酸序列。34.根据权利要求28所述的系统，其中，所述数据库包括：无胃癌的对象的核酸序列。35.一种在从对象获得的样本中筛查肿瘤的方法，所述方法包括：(1)化验从对象获得的样本中的标记的甲基化状态；以及(2)当所述标记的所述甲基化状态不同于没有肿瘤的对象中化验的所述标记的甲基化状态时，将所述对象识别为肿瘤，其中，所述标记包括：从表1、2、4或7的DMR1-274构成的组中选出的差异甲基化区域DMR中的碱基。36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述肿瘤为胃肿瘤。37.根据权利要求35所述的方法，其中，所述肿瘤是胃癌。38.根据权利要求35所述的方法，其中，所述肿瘤是癌前病变。39.根据权利要求35所述的方法，包括化验多个标记。40.根据权利要求35所述的方法，包括化验2-11个标记。41.根据权利要求35所述的方法，包括化验12-107个标记。42.根据权利要求35所述的方法，其中，化验所述样本中的所述标记的所述甲基化状态包括确定一个碱基的所述甲基化状态。43.根据权利要求35所述的方法，其中，化验所述样本中的所述标记的所述甲基化状态包括确定多个碱基处的甲基化范围。44.根据权利要求35所述的方法，其中，所述标记的所述甲基化状态包括：相对于所述标记的正常甲基化状态的所述标记的甲基化增加或降低。45.根据权利要求35所述的方法，其中，所述标记的所述甲基化状态包括：相对于所述标记的正常甲基化状态的所述标记的甲基化的不同模式。46.根据权利要求35所述的方法，包括：化验正向链的甲基化状态或化验反向链的甲基化状态。47.根据权利要求35所述的方法，其中，所述标记是100个或更少碱基的区域。48.根据权利要求35所述的方法，其中，所述标记是500个或更少碱基的区域。49.根据权利要求35所述的方法，其中，所述标记是1000个或更少碱基的区域。50.根据权利要求35所述的方法，其中，所述标记是5000个或更少的碱基的区域。51.根据权利要求35所述的方法，其中，所述标记是一个碱基。52.根据权利要求35所述的方法，其中，所述标记位于高CpG密度启动子中。53.根据权利要求35所述的方法，其中，所述样本是粪便样本、组织样本、胃组织样本、血浆样本或尿液样本。54.根据权利要求35所述的方法，其中，所述化验包括使用甲基化特异性聚合酶链式反应、核酸测序、质谱、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离或目标捕获。55.根据权利要求35所述的方法，其中，所述分化验包括甲基化特异性寡核苷酸的使用。56.一种寡核苷酸，包括从SEQIDNO:1–109构成的组中选出的序列。57.根据权利要求35所述的方法，其中，具有从ARHGEF4,ELMO1,ABCB1,CLEC11A,ST8SIA1,SFMBT2,CD1D,CYP26C1,ZNF569及C13ORF18构成的组中选出的标注的染色体区域包括所述标记。58.根据权利要求35所述的方法，其中，所述DMR来自表4，并从DMRNo.49,43,196,66,1,237,249,250,251及252构成的组中被选出。59.根据权利要求35所述的方法，其中，具有从ELMO1,ARHGEF4,EMX1,SP9,CLEC11A,ST8SIA1,BMP3,KCNA3,DMRTA2,KCNK12,CD1D,PRKCB,CYP26C1,ZNF568,ABCB1,ELOVL2,PKIA,SFMBT2(893),PCBP3,MATK,GRN2D,NDRG4,DLX4,PPP2R5C,FGF14,ZNF132,CHST2(7890),FLI1,c13orf18及ZNF569构成的组中选出的标注的染色体区域包括所述标记。60.根据权利要求35所述的方法，其中，所述DMR来自表2并选自DMRNo.253,251,254,255,256,249,257,258,259,260,261,262,250,263,1,264,265,196,266,118,267,268,269,270,271,272,46,273,252及237。61.根据权利要求35所述的方法，其中，具有从ELMO1,ZNF569,C13orf18,CD1D,ARHGEF4,SFMBT2,PPP25RC,CYP26C1,PKIA,CLEC11A,LRRC4及ST8SIA1构成的组中选出的标注的染色体区域包括所述标记。62.根据权利要求35所述的方法，其中，所述DMR来自表1、2、4和7，并从DMRNo.253,237,252,261,251,196,250,265,256,249及274构成的组中被选出。63.根据权利要求35所述的方法，包括确定两个标记的所述甲基化状态。64.根据权利要求35所述的方法，包括确定表1、2、4或7中提供的一对标记的所述甲基化状态。65.一种试剂盒，包括：(1)亚硫酸氢钠试剂；和(2)对照核酸，包括从表1、2、4和7的DMR1-274构成的组中选出的DMR的序列，并具有与无癌症对象相关的甲基化状态。66.一种试剂盒，包括根据权利要求56的亚硫酸亚铁试剂和寡核苷酸。67.一种试剂盒，包括：用于从对象获取样本的样本收集器；用于从样本中分离核酸的试剂；重亚硫酸盐试剂；和根据权利要求56的寡核苷酸。68.根据权利要求65所述的试剂盒,其中，所述样本是粪便样本、组织样本、胃组织样本、血浆样本或尿液样本。69.一种组合物，包括：含有DMR的核酸和重亚硫酸盐试剂。70.一种组合物，包括：含有DMR的核酸和根据权利要求56的寡核苷酸。71.一种组合物，包括：含有DMR的核酸和甲基化敏感性限制酶。72.一种组合物，包括：含有DMR的核酸和聚合酶。73.一种在从对象获得的样本中筛查胃肿瘤的方法，所述方法包括：(a)确定所述样本中的标记的甲基化状态，所述样本包括从表1、2、4和7的DMR1-274构成的组中被选出的DMR中的碱基；(b)将所述对象样本的所述标记的所述甲基化状态与无胃癌的正常对照样本的所述标记的甲基化状态进行比较；(c)确定所述对象样本和所述正常对照样本的所述甲基化状态中的置信区间和/或p值差异。74.根据权利要求75所述的方法，其中，所述置信区间为90％,95％,97.5％,98％,99％,99.5％,99.9％或99.99％且所述p值为0.1,0.05,0.025,0.02,0.01,0.005,0.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：哈提姆·T·阿拉维，大卫·A·阿尔奎斯特，威廉·R·泰勒，约翰·B·基谢尔，特雷西·C·亚伯，道格拉斯·W·马奥尼，
申请(专利权)人：梅约医药教育及研究基金会，精密科学发展公司，
类型：发明
国别省市：美国,US