抑制-置换基因疗法制造技术

本文提供了用于治疗患有先天性疾病(例如，先天性心脏病，如先天性长QT综合征)的哺乳动物的方法和材料。例如，本文档提供了用于产生核酸并使用所述核酸治疗患有先天性疾病的哺乳动物的方法和材料，其中所述核酸可以抑制所述哺乳动物中的突变疾病相关等位基因的表达，同时提供不含有疾病相关突变的置换cDNA。同时提供不含有疾病相关突变的置换cDNA。同时提供不含有疾病相关突变的置换cDNA。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】syndrome)(Wilde和Amin,《美国心脏病学会杂志.电生理学》,4:569
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579(2018))。
[0006]用于管理LQTS的当前疗法包含提供第一线治疗的β阻断剂以及更具侵入性的疗法，如左侧心交感神经切除术(LCSD)或心脏复律除颤器(ICD)的植入。然而，这些疗法可能具有局限性，包含不顺从性、突破性心脏事件或感染(Rohatgi等人,《美国心脏病学会杂志(J.Am.Coll.Cardiol.)》,70:453
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462(2017)；Priori等人,《心律学》,10:1932
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1963(2013)；Al
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Khatib等人,《心律学》,15:e190
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e252(2018)；Schwartz等人,《循环》,109:1826
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1833(2004)；Bos等人,《循环：心律失常与电生理学杂志(Circ.Arrhythm.Electrophysiol.)》,6:705
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711(2013)；Schwartz等人,《循环》,122:1272
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1282(2010)；Horner等人,《心律学》,7:1616
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1622(2010)；以及Kleemann等人,《循环》,115:2474
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2480(2007))，并且所述疗法不治疗潜在的病原性底物。
[0007]如小干扰RNA(siRNA)等RNA干扰(RNAi)技术利用内源性基因沉默来敲低基因表达。克服LQT2中的显性阴性KCNH2变体的尝试已经使用等位基因特异性siRNA来选择性地敲低突变等位基因(Lu等人,《心律学》,10:128
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136(2013)；以及Matsa等人,《欧洲心脏杂志》,35:1078
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1087(2014))。然而，这种方法的最佳可能结果将是单倍体不足的。另外，将有必要针对每个独特的LQT2致病性变体工程化并验证单独的siRNA，这在KCNQ1、KCNH2和SCN5A中将是不切实际的，因为存在数百个LQT1致病性变体、LQT2致病性变体和LQT3致病性变体(Landrum等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,46:D1062
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D1067(2018))。

技术实现思路

[0008]本文档至少部分地基于开发用于LQT1的双组分“抑制和置换”KCNQ1(KCNQ1
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SupRep)基因疗法方法，其中KCNQ1 shRNA用于抑制内源性KCNQ1等位基因的表达，并且KCNQ1的密码子改变的“shRNA
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免疫”拷贝用于基因置换。如本文所述，“KCNQ1
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SupRep”系统成功地用于挽救诱导性多能干细胞(iPSC)心肌细胞中的延长的动作电位时程，所述iPSC心肌细胞源自来自具有独特的LQT1致病性KCNQ1变体的四名患者的成纤维细胞或PBMC。因此，本文档描述了在LQT1中成功的临床前杂合基因疗法，并且证明本文提供的系统能够完全挽救KCNQ1功能。从理论上讲，KCNQ1
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SupRep基本上可适用于患有LQT1的任何患者，因为它靶向整个KCNQ1基因而不是特异性突变。
[0009]本文档还至少部分地基于开发用于LQT2的“抑制和置换”KCNH2(KCNH2
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SupRep)基因疗法方法，其中KCNQ2 shRNA用于抑制内源性KCNH2等位基因的表达，并且KCNH2的密码子改变的“shRNA
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免疫”拷贝用于基因置换。
[0010]另外，本文档至少部分地基于开发用于LQT3的“抑制和置换”SCN5A(SCN5A
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SupRep)基因疗法方法，其中SCN5A shRNA用于抑制内源性SCN5A等位基因的表达，并且SCN5A的密码子改变的“shRNA
‑
免疫”拷贝用于基因置换。
[0011]与未治疗的LQTS患者心脏的功能相比，使用本文所述的方法和材料具有减少心肌复极化时间(例如，通过缩短APD)的能力可以允许临床医生和患者(例如，LQTS患者)实现更接近地类似于健康心脏的功能的心脏功能。在一些情况下，使用本文所述的方法和材料具有减少LQTS患者的心肌复极化时间的能力可以允许临床医生和患者减轻LQTS症状和/或逆转LQTS进展。例如，向心脏组织递送本文提供的核酸或病毒构建体可以挽救心脏缺陷并且增加LQTS患者的存活率。
[0012]在一方面，本文档的特征在于核酸构建体。所述核酸构建体可以包含(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码细胞内的内源性KCNQ1多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性KCNQ1多肽的表达，以及(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNQ1多肽，其中所述第二核苷酸序列包含与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNQ1多肽在所述细胞内的表达。所述第一核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:36中所示的序列、基本上由其组成或由其组成，并且所述第二核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:9中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。所述第一核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:36中所示的序列、基本上由其组成或由其组成，并且所述第二核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:9中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。所述第一核苷酸序列可以与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列可以与第二启动子可操作地连接。所述第一启动子和所述第二启动子可以是相同的或可以是不同的。所述第一启动子可以是U6启动子，并且所述第二启动子可以是巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子。所述核酸构建体可以进一步包含编码报告基因的核苷酸序列。所述报告基因可以是荧光多肽。编码所述报告基因的所述核苷酸序列可以位于编码所述KCNQ1多肽的所述第二核苷酸序列(例如，编码所述KCNQ1多肽的cDNA)的下游，并且可以通过内部核酶进入序列(IRES)或P2A自切割肽序列与所述第二核苷酸序列分离。所述核酸构建体可以在病毒载体内。所述病毒载体可以是腺相关病毒(AAV)载体(例如，AAV血清型9载体或AAV2/9载体)。所述细胞可以是心肌细胞。
[0013]在另一方面，本文档的特征在于一种病毒颗粒，所述病毒颗粒含有本文所述的核酸构建体(例如，前述段落的核酸构建体)。
[0014]在另一方面，本文档的特征在于一种用于治疗患有先天性心脏病的哺乳动物的方法。所述方法可以包含向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体含有(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸构建体，其包括：(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码细胞内的内源性KCNQ1多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性KCNQ1多肽的表达，以及(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNQ1多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNQ1多肽在所述细胞内的表达。2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:36中所示的序列，并且其中所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:9中所示的序列。3.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ ID NO:36中所示的序列，并且所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:9中所示的序列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一核苷酸序列与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列与第二启动子可操作地连接。5.根据权利要求4所述的核酸构建体，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。6.根据权利要求4所述的核酸构建体，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。7.根据权利要求6所述的核酸构建体，其中所述第一启动子是U6启动子，并且所述第二启动子是巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子。8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸构建体，其进一步包括编码报告基因的核苷酸序列。9.根据权利要求8所述的核酸构建体，其中所述报告基因是荧光多肽。10.根据权利要求8或权利要求9所述的核酸构建体，其中编码所述报告基因的所述核苷酸序列位于编码所述cDNA的所述第二核苷酸序列的下游，并且通过内部核酶进入序列(IRES)或P2A自切割肽序列与所述第二核苷酸序列分离。11.根据权利要求1至10中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体在病毒载体内。12.根据权利要求11所述的核酸构建体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。13.根据权利要求12所述的核酸构建体，其中所述AAV载体是AAV血清型9载体或AAV2/9载体。14.根据权利要求1至13中任一项所述的核酸构建体，其中所述细胞是心肌细胞。15.一种病毒颗粒，其包括根据权利要求1至14中任一项所述的核酸构建体。16.一种用于治疗患有先天性心脏病的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体包括：(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码所述哺乳动物的细胞内的内源性KCNQ1多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性KCNQ1多肽的表达，以及
(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNQ1多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNQ1多肽在所述细胞内的表达。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述先天性心脏病是长QT综合征(LQTS)或短QT综合征(SQTS)。18.根据权利要求16所述的方法，其中所述先天性心脏病是LQT1。19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:36中所示的序列，并且其中所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:9中所示的序列。20.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ ID NO:36中所示的序列，并且所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:9中所示的序列。21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸序列与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列与第二启动子可操作地连接。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。23.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。24.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一启动子是U6启动子，并且所述第二启动子是CMV启动子。25.根据权利要求16至24中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体进一步包括编码报告基因的核苷酸序列。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述报告基因是荧光多肽。27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中编码所述报告基因的所述核苷酸序列位于编码所述cDNA的所述第二核苷酸序列的下游，并且通过IRES与所述第二核苷酸序列分离。28.根据权利要求16至27中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体在病毒载体内。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述病毒载体是AAV载体。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述AAV载体是AAV血清型9载体或AAV2/9载体。31.根据权利要求16至30中任一项所述的方法，其中所述细胞是心肌细胞。32.一种用于减少哺乳动物体内的心脏细胞中的动作电位时程(APD)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体包括：(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码所述哺乳动物的心脏细胞内的内源性KCNQ1多肽的靶序列杂交并且抑制所述心脏细胞内的所述内源性KCNQ1多肽的表达，以及(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNQ1多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNQ1多肽在所述细胞内的表达。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:36中所示的序列，并且其中所述第二核苷酸序列包括
SEQ ID NO:9中所示的序列。34.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ ID NO:36中所示的序列，并且所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:9中所示的序列。35.根据权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸序列与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列与第二启动子可操作地连接。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。37.根据权利要求35所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述第一启动子是U6启动子，并且所述第二启动子是CMV启动子。39.根据权利要求32至38中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体在病毒载体内。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述病毒载体是AAV载体。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述AAV载体是AAV血清型9载体或AAV2/9载体。42.一种用于减轻哺乳动物的LQTS的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体包括：(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码所述哺乳动物的细胞内的内源性KCNQ1多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性KCNQ1多肽的表达，以及(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNQ1多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNQ1多肽在所述细胞内的表达。43.根据权利要求42所述的方法，其中所述LQTS是LQT1。44.根据权利要求42或权利要求43所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:36中所示的序列，并且其中所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:9中所示的序列。45.根据权利要求42或权利要求43所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ ID NO:36中所示的序列，并且所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:9中所示的序列。46.根据权利要求42至45中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸序列与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列与第二启动子可操作地连接。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。48.根据权利要求46所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。49.根据权利要求48所述的方法，其中所述第一启动子是U6启动子，并且所述第二启动子是CMV启动子。50.根据权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体在病毒载体内。51.根据权利要求50所述的方法，其中所述病毒载体是AAV载体。52.根据权利要求51所述的方法，其中所述AAV载体是AAV血清型9载体或AAV2/9载体。53.根据权利要求42至52中任一项所述的方法，其中所述细胞是心肌细胞。54.一种核酸构建体，其包括：(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码细
胞内的内源性KCNH2多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性KCNH2多肽的表达，以及(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNH2多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNH2多肽在所述细胞内的表达。55.根据权利要求54所述的核酸构建体，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ ID NO:27中所示的序列，并且所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:29中所示的序列。56.根据权利要求54或权利要求55所述的核酸构建体，其中所述第一核苷酸序列与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列与第二启动子可操作地连接。57.根据权利要求56所述的核酸构建体，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。58.根据权利要求56所述的核酸构建体，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。59.根据权利要求58所述的核酸构建体，其中所述第一启动子是U6启动子，并且所述第二启动子是CMV启动子。60.根据权利要求54至59中任一项所述的核酸构建体，其进一步包括编码报告基因的核苷酸序列。61.根据权利要求60所述的核酸构建体，其中所述报告基因是荧光多肽。62.根据权利要求60或权利要求61所述的核酸构建体，其中编码所述报告基因的所述核苷酸序列位于编码所述cDNA的所述第二核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔，
申请(专利权)人：梅约医药教育及研究基金会，
类型：发明
国别省市：