一种双酶偶联全细胞催化马来酸合成L-天冬氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种双酶偶联全细胞催化马来酸合成L‑天冬氨酸的方法，属于生物工程领域。本发明专利技术构建了一种偶联表达马来酸顺反异构酶和L‑天冬氨酸裂解酶的重组菌株，并对该重组菌株进行改造优化，获得能够全细胞高转化率催化马来酸生成L‑天冬氨酸的重组菌。该重组菌株能够利用价格相对便宜的马来酸生成L‑天冬氨酸，反应40～120min，马来酸反应完全，而且几乎没有中间产物富马酸的积累，转化率到达98％以上。

【技术实现步骤摘要】
一种双酶偶联全细胞催化马来酸合成L-天冬氨酸的方法
本专利技术涉及一种双酶偶联全细胞催化马来酸合成L-天冬氨酸的方法，属于生物工程领域。
技术介绍
L-天冬氨酸(L-asparticacid)是构成蛋白质的20种基础氨基酸之一。其在食品、医药、化工等领域都有着广泛的应用和较大的市场开发潜力。目前，工业生产L-天冬氨酸的工艺主要是以顺丁烯二酸酐为原料，在无机催化剂、强酸性(pH＝1左右)条件下转化成富马酸；分离纯化获得富马酸，然后富马酸与过量的氨在L-天冬氨酸裂解酶催化下转化生成L-天冬氨酸铵，反应液用硫酸中和过量的氨后，分离纯化得到产品L-天冬氨酸。此工艺虽然流程简单，但是其缺点明显：需要在高温、高压、过渡金属催化剂及强酸性条件下进行，对设备的要求严格，造成的环境污染严重，同时需要分离纯化中间产物富马酸，会造成产率的下降等。相比较而言，双酶偶联全细胞催化转化法具有专一性强，转化率高、工艺简洁、设备投资少及环境污染小等优点，因此双酶偶联全细胞催化转化法具有更好的应用前景。目前，关于双酶偶联全细胞催化马来酸合成L-天冬氨酸的研究还较少，大多数都还是停留在以富马酸为底物的研究基础上，主要原因受限于马来酸顺反异构酶的稳定性差、酶活低、难以异源表达。
技术实现思路
本专利技术提供了一种偶联表达马来酸顺反异构酶(粘质沙雷氏菌来源)和L-天冬氨酸裂解酶(大肠杆菌来源)的重组菌株，并对该重组菌株进行改造优化，获得能够全细胞高转化率催化马来酸生成L-天冬氨酸的重组菌。所述偶联表达马来酸顺反异构酶和L-天冬氨酸裂解酶的重组菌株，是以大肠杆菌为宿主，表达以pRSFDuet-1为表达载体构建的重组表达载体pRSFDuet-1-maiA-aspA。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌是敲除了基因组中fumA-fumC基因的E.coliBL21(DE3)△fumAC。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述马来酸顺反异构酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述L-天冬氨酸裂解酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述马来酸顺反异构酶的第27位的甘氨酸突变为丙氨酸并且第171位的甘氨酸突变为丙氨酸；或者第27位的甘氨酸突变为丙氨酸并且第104位的赖氨酸突变为精氨酸。在本专利技术的一种实施方式中，还在SEQIDNO.4基础上将编码L-天冬氨酸裂解酶的基因的RBS序列替换为SEQIDNO.23或SEQIDNO.24或SEQIDNO.25所示的序列。本专利技术还提供应用所述重组菌株全细胞转化马来酸生成L-天冬氨酸的方法，是以pH8.0的2M的马来酸溶液为底物，加入菌体浓度OD600为40的静息细胞悬液，静息细胞悬液与底物溶液的体积比为2：8。所述方法在pH8.0的50mM的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液中进行，反应温度为37℃。本专利技术提供了一株能高效表达马来酸顺反异构酶和L-天冬氨酸裂解酶的重组菌株，能够利用价格相对便宜的马来酸生成L-天冬氨酸，反应40～120min，马来酸反应完全，而且几乎没有中间产物富马酸的积累，转化率到达98％以上。附图说明图1MaiA与AspA偶联表达的不同策略图2PCR扩增maiA和aspA基因及重组质粒的酶切验证结果：M:marker；1BamHI-maiA-HindIII的PCR产物；2NdeI-maiA-XhoI的PCR产物；3HindIII-maiA-XhoI的PCR产物；4BamHI-aspA-HindIII的PCR产物；5NdeI-aspA-XhoI的PCR产物；6HindIII-aspA-XhoI的PCR产物；7pRSFDuet-1-maiA重组质粒的双酶切验证；8pRSFDuet-1-aspA重组质粒的双酶切验证；9pETDuet-1-maiA重组质粒的双酶切验证；10pETDuet-1-aspA重组质粒的双酶切验证；11pET-28a(+)-maiA重组质粒的双酶切验证；12pET-28a(+)-aspA重组质粒的双酶切验证；13pRSFDuet-1-aspA-maiA重组质粒的双酶切验证；14pRSFDuet-1-maiA-aspA重组质粒的双酶切验证；15pET-28a(+)-maiA-aspA重组质粒的双酶切验证；16pET-28a(+)-aspA-maiA重组质粒的双酶切验证图3不同偶联表达的SDS-PAGE结果：M:marker；1pRSFDuet-1-maiA表达结果；2pRSFDuet-1-aspA表达结果；3pMA1表达结果；4pAM1表达结果；5pMA2表达结果；6pAM2表达结果；7pMA3表达结果；8pAM3表达结果；图4pMA2全细胞催化结果图5pMA2中的MaiA的RBS改造后SDS-PAGE结果：M:marker；1pMA2表达结果；2pMA2-1表达结果；3pMA2-2表达结果；4pMA2-3表达结果；5pMA2-4表达结果；图6pMA2-4全细胞催化结果图7pMA2-4(G27A-G171A)全细胞催化结果图8pMA2-4(G27A-K104R)全细胞催化结果具体实施方式马来酸、富马酸和L-天冬氨酸的检测方法：马来酸、富马酸和L-天冬氨酸的浓度都用高效液相色谱(HPLC)法检测。马来酸、富马酸的HPLC检测条件：色谱柱PrevailOrganicAcid(250mm×4.6mm,5m；GraceDavisonDiscoverySciences)，流动相为pH2.5、浓度25mM的K2HPO4溶液，流速1mL/min，柱温40℃，紫外检测器波长210nm，进样量10μL。L-天冬氨酸的检测要先经过苯基异硫酸酯(PITC)进行衍生，在其氨基端连接一个苯环，便于分离。衍生方法为：取500μL反应液，加入250μL1M的三乙胺-乙腈溶液和250μL0.1M的PITC-乙腈溶液，振荡混匀，避光反应1h。待衍生结束后，700μL正己烷，振荡30s萃取出残余的衍生试剂，静置，待反应液有明显分层后吸取下层溶液，用0.22μm针头式有机滤膜过滤。HPLC检测条件：色谱柱LaChromC18(5μm,4.6mm×250mm)，用梯度洗脱的方法进行检测。A流动相为80％的乙腈溶液，B流动相为97:3的0.1M乙酸钠-乙腈溶液；梯度洗脱条件为：0～35min，B流动相由95％降至65％；35～40min，B流动相由65％升至95％；40～45min，B流动相浓度不变。检测温度为40℃，检测波长为254nm。实施例1构建偶联表达马来酸顺反异构酶和L-天冬氨酸裂解酶的重组菌株1)马来酸顺反异构酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，编码马来酸顺反异构酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；L-天冬氨酸裂解酶的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，编码L-天冬氨酸裂解酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。根据目的基因和载体，选择酶切位点，设计引物(如表1)；表1酶切连接引物设计注：下划线标出的为酶切位点2)分别以pET-24a(+)–maiA和pET-28a(+)–aspA为模板进行PCR，得到如图2a所示的带不同酶切位点的maiA和aspA基因片段：BamHI-maiA-HindIII、NdeI-maiA-X本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备L‑天冬氨酸的方法，其特征在于，以偶联表达马来酸顺反异构酶和L‑天冬氨酸裂解酶的重组菌株或该重组菌株产生的酶为催化剂，以马来酸为底物，生成L‑天冬氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种制备L-天冬氨酸的方法，其特征在于，以偶联表达马来酸顺反异构酶和L-天冬氨酸裂解酶的重组菌株或该重组菌株产生的酶为催化剂，以马来酸为底物，生成L-天冬氨酸。2.根据权利要求1所述的一种制备L-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述偶联表达马来酸顺反异构酶和L-天冬氨酸裂解酶的重组菌株，是以大肠杆菌为宿主，表达以pRSFDuet-1为表达载体构建的重组表达载体pRSFDuet-1-maiA-aspA。3.根据权利要求1或2所述的一种制备L-天冬氨酸的方法，其特征在于，马来酸顺反异构酶来源于粘质沙雷氏菌，L-天冬氨酸裂解酶来源于大肠杆菌。4.根据权利要求3所述的一种制备L-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述大肠杆菌是敲除了基因组中fumA-fumC基因的E.coliBL21(DE3)ΔfumAC。5.根据权利要求1或2所述的一种制备L-天冬氨酸的方法，其特征在于，编码所述马来酸顺反异构酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，或者编码第27位的甘氨酸的密码子突变为编码丙氨酸的密码子并且编码第171位的甘氨酸的密码子突变为编码丙氨酸的密码子，或者编码第27位的甘氨酸的密码子突变为编码丙氨酸的密码子并且编码第104位的赖氨酸的密码子突变为编码精氨酸的密码子；编码所述L-天冬氨酸裂解酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。6.根据权利要求1或2或5所...

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，余龙，周丽，崔文璟，刘中美，郭军玲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32