一种定量检测C反应蛋白的试剂盒及制备方法技术

本发明专利技术提供了一种定量检测C反应蛋白的试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括标记示踪物的C反应蛋白的单克隆抗体；包被有C反应蛋白的单克隆抗体的载体；C反应蛋白校准品和洗涤液；化学发光底物液。同时，试剂盒的制备方法包括，示踪物标记C反应蛋白的单克隆抗体；以C反应蛋白的单克隆抗体包被载体；以C反应蛋白纯品配制CRP校准品；分装上述C反应蛋白校准品、标记示踪物的C反应蛋白的单克隆抗体、和该示踪物所作用的化学发光底物；组装为成品。本发明专利技术的试剂盒灵敏度高，特异性好，定量检测结果准确度高，使用成本低，更易推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测C反应蛋白的试剂盒及制备方法
本专利技术涉及生物医学领域，特别涉及一种定量检测C反应蛋白的试剂盒及其制备方法。
技术介绍
C－反应蛋白（C-neactveprotein,简称CRP），早于1930年发现，是一种能与肺炎球菌C多糖体反应形成复合物的急性时相反应蛋白。并且在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质（急性蛋白），激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用，清除入侵机体的病原微生物和损伤，坏死，凋亡的组织细胞。近年来，由于检测技术的更新，测定CRP的快速、简便和可靠的方法已迅速建立。使CRP在临床应用领域大大增加，其在医学上的价值正得到广泛验正和承认。CRP在炎症开始数小时就升高，48小时即可达峰值，随着病变消退、组织、结构和功能的恢复降至正常水平。此反应不受放疗、化疗、皮质激素治疗的影响。因此，CRP的检测在临床应用相当广泛，包括急性感染性疾病的诊断和鉴别诊断，手术后感染的监测；抗生素疗效的观察；病程检测及预后判断等。现有技术检测血清学指标的方法主要包括放射性同位素免疫分析、生化免疫分析、酶联免疫吸附方法和化学发光免疫分析。近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。但现有技术中对CRP的检测方法一般都有各自的特点及不足：放射性同位素免疫分析结果比较准确，缺点是耗时长，操作复杂，放射性标记物会对实验人员产生危害，并且会产生环境污染，目前已经逐渐被其他方法所替代；生化免疫法已被广泛应用，但其检测灵敏度低；酶联免疫吸附方法目前存在结果受环境影响大，灵敏度低等缺点，并且不适合随机检测；现有技术的使用化学发光免疫分析技术在CRP免疫分析产品的应用多为定性检测，定量检测的技术也存在灵敏度低，特异性差的缺点，主要是所使用的抗体原料的亲和力弱引起，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。
技术实现思路
本专利技术提供一种定量检测C反应蛋白的试剂盒及制备方法，克服现有技术的只能定性检测或者定量检测灵敏度低，特异性差的缺点。本专利技术研制的C反应蛋白测定试剂盒（化学发光法）采用的是双抗体夹心一步法反应模式，采用C反应蛋白单克隆抗体制备固相，特异性的单克隆抗体纯度高、无传染性，非特异结合反应小，可以大批量生产，同时本专利技术的试剂盒灵敏度高，特异性好，定量检测结果准确度高，使用成本低，更易推广应用。一方面，本专利技术提供了一种定量检测C反应蛋白的试剂盒，本专利技术的试剂盒包括：1）吖啶脂标记的C反应蛋白的单克隆抗体；2）包被有C反应蛋白的单克隆抗体的载体；3）C反应蛋白校准品；4）上述吖啶脂所作用的化学发光底物。另一方面，本专利技术提供了一种定量检测C反应蛋白的试剂盒的制备方法，该方法包括：1）用吖啶脂标记C反应蛋白的单克隆抗体；2）以C反应蛋白的单克隆抗体包被载体；3）以C反应蛋白纯品配制C反应蛋白校准品；4）分装上述C反应蛋白校准品、吖啶脂标记的C反应蛋白的单克隆抗体和该酶所作用的化学发光底物；5）组装为成品。在上述根据本专利技术的试剂盒及其制备方法中，所述载体可以为固相载体、磁性微粒、微孔板、塑料管或塑料珠；在其中一个实施例中，所述载体优选为磁性微粒：由于其表面积大及结合蛋白能力强所述吖啶类衍生物可以为吖啶酯，吖啶酮类化合物，吖啶磺酰胺类化合物或吖啶基氨基乙酸。所述化学发光底物为过氧化脲或过氧化氢，二氧乙烷类衍生物，鲁米诺或异鲁米诺。在根据本专利技术的方法中，其中所述包被载体的步骤（2）可以包括以下过程：1.称量0.2g的NaH2PO4·2H2O,2.9g的NaH2PO4·12H2O于1L的洁净容器中，加入1L的双蒸水溶解混匀后，PH为7.0～7.5；2.加入适量CRP单抗和偶联剂，与固相载体2～8℃反应16-24h；3.生理盐水洗涤；4.用磷酸盐缓冲液进行保存；其中，所述保存液，基于1000mL所述保存液包含0.2gNaH2PO4·2H2O，2.9gNaH2PO4·12H2O、10gBSA、和1mLProclin300,pH值为7.0～7.5。在本专利技术的过程中，专利技术人发现，CRP抗体原料的筛选，对CRP定量检测的灵敏度有较大影响；在本专利技术的其中一个实施例中，CRP不同配对的包被单克隆抗体和标记单克隆抗体要求这些CRP单克隆抗体，纯度不低于90％；其中，包被抗体浓度为2μg/mL-5μg/mL，低或高于于此浓度，会使CRP定量检测的灵敏度偏低；标记抗体稀释比为1：10000-1:40000，低或高于于此标记抗体稀释比，会降低CRP定量检测的灵敏度（具体见实施例3）。本领域技术人员已知，化学发光定量检测试剂盒的一般孵育时间为60min；孵育温度为37℃；不同的孵育温度和时间对试剂盒定量检测准确度有较大的影响。在本专利技术的过程中，专利技术人发现，CRP定量检测使用的双抗体夹心一步法的反应模式和反应条件最终也会影响试剂盒（具体见实施例4）。具体的，上述试剂盒可以包括CRP校准品、抗体包被磁微粒、吖啶脂标记物与化学发光底物液、浓缩洗涤液等。其中，所述CRP校准品为标准级，纯度不低于90%；抗体包被磁微粒为2-3μm的磁性微球；吖啶脂标记物为吖啶脂的衍生物；化学发光底物液为HNO3、H2O2和NaOH；浓缩洗涤液为磷酸盐缓冲液。本专利技术“C反应蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒”可以准确地定量检测出病人CRP的含量，可以根据CRP含量，对急性感染的病情进行监测、疗效评价和预后的判断有重要意义。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。根据本专利技术的试剂盒，吖啶脂标记的CRP单抗与载体上包被的CRP单抗和被测样品的CRP抗原形成双抗体夹心的结构，因此本专利技术采用的“双抗体夹心一步法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。进一步地，本专利技术中对原料进行了筛选及优化，原料的筛选将影响包括标记抗体与包被抗体的活性、载体的吸附性能和变异大小等；最终影响试剂盒的灵敏度和特异性。更进一步地，本专利技术对试剂盒的反应模式和条件进行了优化，试剂盒的反应模式和反应条件将影响定量检测的准确性。对试剂盒反应模式和条件的确定更有利于广泛推广和适用。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是试剂盒校准曲线图，以校准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标绘出标准曲线，其中线性方程为y=10863x-14307，r=0.9993；图2为试剂盒制备方法的流程图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1CRP吖啶脂标记单抗的制备取一定量CRP单克隆抗体，采用0.02mol/LpH9.6CB调整浓度为2mg/mL；按抗体：吖啶酯=1：10～20摩尔比加入已活化吖啶酯，室温反应1.0h；将反应液移至透析袋（截留本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量检测C反应蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括标记示踪物的C反应蛋白的单克隆抗体；包被有C反应蛋白的单克隆抗体的载体； C反应蛋白校准品和洗涤液；化学发光底物液。

【技术特征摘要】
1.一种定量检测C反应蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括标记示踪物的C反应蛋白的单克隆抗体；包被有C反应蛋白的单克隆抗体的载体；C反应蛋白校准品和洗涤液；化学发光底物液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述示踪物为吖啶类衍生物、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述吖啶类衍生物可以为吖啶酯，吖啶酮类化合物，吖啶磺酰胺类化合物或吖啶基氨基乙酸。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述载体为磁性颗粒、微孔板、塑料珠或塑料管。5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，磁性颗粒为2-3μm的磁性微球。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述C反应蛋白的单克隆抗体浓度为4μg/mL。7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标记示踪物的C反应蛋白的单克隆抗体的稀释比为1:...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡国富，朱炎，
申请(专利权)人：浙江艾明德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33