本发明专利技术提供了一种检测尿嘧啶‑DNA糖基化酶（UDG）的荧光生物传感器，包括环形模板、发卡探针、荧光探针、dNTP、phi 29 DNA聚合酶、核酸内切酶IV。本发明专利技术的生物传感器特异性好、灵敏度高，反应条件温和、反应速度快；采用银簇荧光检测，操作简便、检测周期短、易携带；工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求；制备方法简单，性能稳定，重复性好。
【技术实现步骤摘要】
一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）的荧光生物传感器
本专利技术属于生物传感器
，涉及一种基于核酸内切酶放大和滚环扩增检测DNA糖基化酶的荧光生物传感器。
技术介绍
水解胞嘧啶生成尿嘧啶是DNA水解损伤中最常见的一种形式，从而导致在DNA复制过程中G：C碱基对转变成A：U碱基对。尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）是一种蛋白酶，它具有基本的切除修复酶活性，在维持基因组完成性方面起着至关重要的作用。作为碱基切除修复路径的启动者和一种针对不受欢迎的异常碱基的“侦察员”，UDG由于具有对尿嘧啶的高特异性，因此可作用于识别和催化单链或双链DNA上的N-糖苷键的水解和分裂。随后，便产生了一种无嘌呤无嘧啶的位点（AP位点）并触发DNA修复过程，并通过附加酶的协调作用来移除AP位点，以取代正常的胞嘧啶碱基。异常的UDG作用可以诱发基因突变与多种疾病直接相关包括癌症，基因型疾病，人类免疫缺陷。因此，作为一种潜在的生物标志物，UDG的灵敏性和直接的检测对基础功能研究和临床诊断都具有重要意义。传统的UDG活性检测方法包括凝胶电泳法，质谱分析法，放射性标记法。近年来，各种生物传感技术，如电化学法、比色法、光学法等已被开发应用，以提高灵敏度和特异性，提高安全性，缩短检测时间。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中检测UDG的方法特异性和灵敏度都比较低、检测周期长的问题，本专利技术提供了一种特异性和灵敏度高、检测速度快的基于内切酶辅助滚环扩增放大的荧光法检测DNA糖基化酶的生物传感器及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）的荧光生物传感器，包括环形模板、发卡探针、荧光探针、dNTP、phi29DNA聚合酶、核酸内切酶IV；所述环形模板的序列如SEQNo.1所示；所述发卡探针的序列如SEQNo.2所示；所述荧光探针的序列如SEQNo.3所示，其5’端第10位碱基为无碱基位点，紧邻上述位点5’端T修饰荧光基团，紧邻上述位点3’端T修饰荧光猝灭基团；所述荧光探针3’端修饰C3spacer。所述荧光探针的荧光基团与相应荧光猝灭基团优选为6-羧基荧光素（FAM）和4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸（Dabcyl）。所述环形模板采用以下方法获得：（1）将线性模板与连接探针在T4DNA连接酶缓冲液中杂交，然后加入T4DNA连接酶低温下反应，然后灭活T4DNA连接酶；（2）上述体系中加入核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ反应，然后灭活核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ，得环形模板；所述线性模板的序列如SEQNo.4所示，其5’端修饰磷酸基团；所述连接探针的序列如SEQNo.5所示。所述T4DNA连接酶的反应温度为16-20℃，反应时间为12-20h。所述步骤（1）和（2）中灭活酶的步骤为高温灭活；灭活T4DNA连接酶的条件优选为65℃下15min；灭活核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ的条件优选为85℃下10min。所述T4DNA连接酶反应缓冲液含有50mMTris-HCl，10mMMgCl2，10mM二硫苏糖醇（DTT）和1mMATP。一种利用上述荧光生物传感器检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的方法，包括以下步骤：（1）将环状模板、发卡探针、dNTP、phi29DNA聚合酶、核酸内切酶IV在缓冲液中混合后分别加入系列浓度UDG酶的标准溶液或待测液，混匀后37℃恒温反应；（2）向步骤（1）的溶液中加入荧光探针，混匀后37℃恒温反应；（3）将步骤（2）所得溶液进行荧光检测；根据系列浓度UDG酶的标准溶液做UDG酶浓度-荧光强度的标准曲线，计算回归方程；根据待测液的荧光强度，计算含UDG酶的浓度。所述核酸内切酶IV的浓度为1-30U/mL，优选为20-30U/mL；所述发卡探针的浓度为0.5-50nM，优选为10-50nM；所述步骤（2）的反应时间为10-40min，优选为30-40min；所述荧光探针的浓度为1-20μM，优选为10-20μM。所述步骤（3）中，激发波长设置为486nm，发射波长为518nm，检测范围450nm-530nm。本荧光生物传感器的工作原理如下：在线性模板5’端修饰了磷酸基团，并且在5’端和3’端包含与连接探针的互补的碱基。线性挂锁探针与连接探针结合，在T4DNA连接酶的作用下，形成环形模板-连接探针的复合体，当有核酸外切酶I和外切酶III存在时，对引物进行消化，从而形成环形模板备用。在发卡探针包含尿嘧啶脱氧核糖核苷的修饰位点，和能够与环形模板互补的序列。荧光探针中分别修饰了FAM荧光基团和Dabcyl淬灭基团，并含有无嘌呤无嘧啶位点（AP位点），3’修饰的C3spacer用于防止核酸外切酶和聚合酶发挥作用。当有目标物UDG存在时，UDG能够识别预先修饰有尿嘧啶的发夹探针并对糖苷键进行水解作用，随后产生一个无嘌呤无嘧啶的AP位点。随后，核酸内切酶IV识别AP位点并进行切割使发夹探针断裂形成两条单链DNA。其中一条链能够与预先制备的环形模板结合，进行滚环扩增放大，产生的单链DNA能够与带有AP位点修饰的荧光探针结合，在核酸内切酶的辅助作用下，使探针断裂，从而荧光基团与淬灭基团分离，释放荧光基团，产生一定强度的荧光信号。本专利技术具有以下优点：本专利技术的生物传感器特异性好、灵敏度高，反应条件温和、反应速度快；采用银簇荧光检测，操作简便、检测周期短、易携带；工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求；制备方法简单，性能稳定，重复性好。附图说明图1为本荧光生物传感器的工作原理；图2为荧光强度随核酸内切酶IV浓度的变化曲线图；图3为荧光强度随发卡探针浓度的变化；图4为荧光强度随荧光探针反应时间的变化；图5为荧光强度随荧光探针浓度的变化；图6为实施例6中检测UDG酶的标准曲线。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例中使用序列如下：线性模板：5’-p-CTGAGCTACGTAGTATCAGATAGATCTGTCAAGTCTGATAGTAGTATCAGATAGATCTGACGGC-3’连接探针：5’-CGTAGCTCAGGCCGTCAG-3’发卡探针：5’-GTGATACTGATTTCAGGCCGTCAGUATCAC-3’荧光探针：5’-GTAGTAT(FAM)CAXAT(Dabcyl)AGATCTG-C3Spacer-3’。实施例1环形模板的制备。配制含50mMTris-HCl，10mMMgCl2，10mMDTT和1mMATP的T4DNA连接酶反应缓冲液。（1）将42μL灭菌水，6μL线性模板（100nM），6μL连接探针（100nM）和6μL10×的T4DNA连接酶缓冲液混匀，95℃变性5min，然后慢慢冷却至室温完成杂交，然后在反应体系里添加3μLT4DNA连接酶（60U/μL），将其在16℃下反应20小时；之后，反应体系在65℃温度条件下水浴15分钟，灭活体系中的T4DNA连接酶；（2）向上述反应体系中加入3μL核酸外切酶Ⅰ（20U/μL）和3μL的核酸外切酶Ⅲ（100U/μL）37℃下反应2h；再将反应体系85℃水浴加热10min，得环形模板，4℃条件下保藏备用。实施例2荧光强度随核酸内切酶IV浓度的变化。（1）将3μL环状模板（10nM）、3μL发卡探本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测尿嘧啶‑DNA糖基化酶（UDG）的荧光生物传感器，其特征在于，包括环形模板、发卡探针、荧光探针、dNTP、phi 29 DNA聚合酶、核酸内切酶IV；所述环形模板的序列如SEQ No.1所示；所述发卡探针的序列如SEQ No.2所示；所述荧光探针的序列如SEQ No.3所示，其5’端第10位碱基为无碱基位点，紧邻上述位点5’端T修饰荧光基团，紧邻上述位点3’端T修饰荧光猝灭基团；所述荧光探针3’端修饰C3 spacer。
【技术特征摘要】
1.一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）的荧光生物传感器，其特征在于，包括环形模板、发卡探针、荧光探针、dNTP、phi29DNA聚合酶、核酸内切酶IV；所述环形模板的序列如SEQNo.1所示；所述发卡探针的序列如SEQNo.2所示；所述荧光探针的序列如SEQNo.3所示，其5’端第10位碱基为无碱基位点，紧邻上述位点5’端T修饰荧光基团，紧邻上述位点3’端T修饰荧光猝灭基团；所述荧光探针3’端修饰C3spacer。2.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，荧光探针的荧光基团与相应荧光猝灭基团优选为6-羧基荧光素和4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸。3.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述环形模板采用以下方法获得：（1）将线性模板与连接探针在T4DNA连接酶缓冲液中杂交，然后加入T4DNA连接酶低温下反应，然后灭活T4DNA连接酶；（2）上述体系中加入核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ反应，然后灭活核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ，得环形模板；所述线性模板的序列如SEQNo.4所示，其5’端修饰磷酸基团；所述连接探针的序列如SEQNo.5所示。4....
【专利技术属性】
技术研发人员：黄加栋，王敬锋，王玉，刘素，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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