本发明专利技术涉及分子生物学领域，具公开了一种同时表达靶向CD19和CD20的CAR与PD1‑CD28嵌合受体的慢病毒载体。所述慢病毒载体通过同时高效表达靶向CD19和CD20的CAR和PD1‑CD28嵌合体，使该载体感染的T细胞不仅可以靶向识别表达CD19和CD20的肿瘤细胞，而且可以解除PD‑L1/PD1介导的免疫抑制，从而发挥更强地杀伤肿瘤细胞的能力。进一步地，本发明专利技术优化了载体中关键元件的选择和连接顺序，提高靶向CD19和CD20的CAR和PD1‑CD28嵌合体在人类T细胞中的表达效率。
【技术实现步骤摘要】
一种同时表达靶向CD19和CD20的CAR与PD1-CD28嵌合受体的慢病毒载体
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种同时表达靶向CD19和CD20的CAR与PD1-CD28嵌合受体的慢病毒载体。
技术介绍
近年来，抗CD19的CAR-T在治疗复发，耐药，难治B细胞白血病和淋巴瘤方面取得了举世瞩目的成就，引起世界各国肿瘤临床医生的极大兴趣。但是仅靶向CD19的CAR-T治疗B细胞来源肿瘤会导致肿瘤细胞CD19低表达或不表达，从而导致肿瘤细胞免疫逃逸而产生复发和耐药。因此同时靶向CD19和CD20的CAR可以同时靶向B细胞来源肿瘤的CD19和CD20两个靶点，因此对于B细胞来源肿瘤尤其是CD19CAR-T治疗失败的患者，双靶点CAR-T会取得较好的治疗效果。CD19和CD20是B细胞系的细胞，包括正常的B细胞，前B细胞，B细胞淋巴瘤和白血病细胞，特异性表达的两个膜蛋白,其他细胞和组织都不表达CD19和CD20。研究表明，阻断PD-L1/PD1介导的免疫抑制将会是CAR-T成功用于治疗恶性肿瘤的关键。阻断PD-L1和PD1的结合，理论上就可以消除PD1信号对T细胞的抑制，激活T细胞的免疫反应，起到抗肿瘤的效果。目前，FDA批准了两个抗PD1的单抗Nivolumab和Pembrolizumab用于治疗其他疗法已失败的转移性非小细胞肺癌和黑色素瘤。虽然我国黑色素瘤的发病率并不高，但肺癌是我国第一大癌，同时也是死亡率最高的癌症。其中的非小细胞肺癌，生存率极低。5年生存率不容乐观。目前，国家食品药品监督总局(CFDA)尚未批准Nivolumab和Pembrolizumab在国内临床使用。而且Nivolumab和Pembrolizumab需要多次使用，对大多数患者来说，医疗负担过重。针对PD-L1的单抗也能起到类似的抗肿瘤效果。根据目前已经报道的临床研究，MPDL3280A(anti-PD-L1人源单抗)在治疗黑色素瘤，非小细胞肺癌，直结肠癌(colorectalcancer)和膀胱癌(bladdercancer)都取得了不同程度的疗效。MEDI4736是另外一个人源抗PD-L1单克隆抗体，它能阻断PD-L1和PD1的结合，使得T细胞能够识别和杀死肿瘤细胞。对于MEDI4736的临床抗肿瘤效果正在多个中心展开，其中也包括非小细胞性肺癌和头颈部肿瘤。鉴于抗PD-L1/PD1抗体免疫治疗在我国的应用问题，急需提供一种可替代的治疗产品及方法。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种同时表达靶向CD19和CD20的CAR与PD1-CD28嵌合受体的慢病毒载体及其构建方法与应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供一种同时表达靶向CD19和CD20的CAR与PD1-CD28嵌合受体的慢病毒载体。PD1和CD28都属于CD28蛋白家族的成员。T细胞激活不仅需要抗原结合到TCR(T细胞受体)激活的信号，同时还需要共刺激分子(如CD28)提供的防止免疫无能(anergy)的信号。CD28是CD4+TH和CD8+CTL细胞的主要共刺激受体，而PD1是防止活化的T细胞免疫过激和自身免疫病的关键免疫闸门分子。研究发现，融合CD28膜外区和PD1膜内区的嵌合蛋白表现出类似于天然PD1分子抑制T细胞免疫反应的活性。相对应的，把PD1的膜外区和CD28的跨膜区和膜内区融合在一起，形成的嵌合蛋白能够结合PD-L1，但却促进T细胞激活，包括细胞因子释放增加，细胞增殖增加，细胞杀伤力增强。回输表达PD1-CD28嵌合受体的T细胞给负荷肿瘤的小鼠，能够彻底清除肿瘤。这些试验说明这两个蛋白的不同功能区可以很好的兼容在一起，组合形成一个新的，能够调节T细胞免疫反应的人工受体。进一步研究发现，PD1-CD28嵌合受体能够把PD-L1/PD1传导的本来是抑制T细胞活性的信号，转换成刺激T细胞激活的信号。而且，肿瘤组织表达大量PD-L1，PD1-CD28嵌合受体借助于PD-L1提供的信号，化抑制为刺激，促进T细胞的抗肿瘤活性。本专利技术将靶向CD19和CD20的CAR与PD1-CD28嵌合受体共同构建于同一慢病毒载体进而转入患者T细胞，使该基因修饰的T细胞不仅可以靶向识别表达CD19和CD20的肿瘤细胞，还可以解除肿瘤细胞表达的PD-L1对T细胞的免疫抑制，实现了良好的抗肿瘤效果。进一步地，由于慢病毒感染外周血T细胞的效率普遍不高，而且多个目的基因在同一载体上表达时，所表达的蛋白活性及表达效率亦会下降。为了促进靶向CD19和CD20的CAR和PD1-CD28嵌合受体在T细胞中均可进行高效的表达，本专利技术进一步优选了慢病毒载体启动子种类以及这两个目的基因的连接方式，以求对T细胞发挥最佳的感染效率。基于此目的，本专利技术通过在慢病毒表达载体中，使两个目的基因共用一个启动子EF1α，并在两者间使用Furin-linker-spacer-F2A进行连接，使得该慢病毒载体产生的慢病毒可以高效感染外周血T细胞，而且靶向CD19和CD20的CAR与PD1-CD28嵌合体可以分别表达于该T细胞表面。更为具体地说：所述慢病毒载体携带两个目的基因，先通过转染试剂转染293ft细胞产生慢病毒，然后慢病毒感染外周血T细胞，进而将两个目的基因整合进T细胞基因组，从而实现这两个目的基因在T细胞内表达。所述Furin-linker-spacer-F2A在本文中可简称为2A肽，在图3中表示为F2A。由于Furin和F2A肽的剪切作用，上游蛋白(靶向CD19和CD20的CAR)的C端仅含有1到3个额外的氨基酸残基，下游蛋白(PD1-CD28嵌合体)的N端仅含有额外的脯氨酸残基。经实验研究后，这些氨基酸残基不影响这两个蛋白正常表达。进一步地，所述慢病毒载体优选为所述慢病毒载体选自启动子为EF1α的慢病毒载体。如此，则无需对慢病毒载体的启动子进行替换，直接使用慢病毒载体自带的EF1α启动子即可。自带EF1α启动子的慢病毒载体可通过商业途径购买获得。例如，在本专利技术的具体实施方式中，所使用的自带EF1α启动子的慢病毒载体为pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato，购自武汉淼灵生物科技有限公司。所述靶向CD19和CD20的CAR的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述2A肽的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述PD1-CD28的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。第二方面，本专利技术提供前述慢病毒载体的构建方法，包括如下步骤：(1)将表达靶向CD19和CD20的CAR与PD1-CD28嵌合受体的核苷酸序列使用Furin-linker-spacer-F2A进行连接，合成融合基因，合成所述融合基因时在其两端分别包含XbaI和SalI酶切位点，并将其装载在质粒上；(2)利用XbaI和SalI双酶切步骤(1)所述质粒，切胶回收目的基因片段；(3)利用XbaI和SalI双酶切慢病毒原始载体，切胶回收的载体片段；(4)利用DNA连接酶将步骤(2)回收的目的基因片段与步骤(3)回收的载体片段连接，即得本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同时表达靶向CD19和CD20的CAR与PD1‑CD28嵌合受体的慢病毒载体，其特征在于，所述靶向CD19和CD20的CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PD1‑CD28嵌合受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
【技术特征摘要】
1.一种同时表达靶向CD19和CD20的CAR与PD1-CD28嵌合受体的慢病毒载体，其特征在于，所述靶向CD19和CD20的CAR的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述PD1-CD28嵌合受体的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。2.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，将表达靶向CD19和CD20的CAR与PD1-CD28嵌合受体的核苷酸序列使用Furin-linker-spacer-F2A进行连接，得到融合基因，将该融合基因构建于慢病毒载体中；所述Furin-linker-spacer-F2A的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。3.根据权利要求2所述的慢病毒载体，其特征在于，表达靶向CD19和CD20的CAR的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；表达PD1-CD28嵌合受体的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。4.根据权利要求1～3任一项所述的慢病毒载体，其特征在于，在所述融合基因的上游插入启动子，所述启动子可在T细胞内高效表达。5.根据权利要求4所述的慢病毒载体，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆哲明，张超亭，
申请(专利权)人：北京市肿瘤防治研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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