一种细胞软骨基质及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种脱细胞软骨基质及其制备方法，属于关节软骨技术领域。包括如下步骤：(1)在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以50‑300rpm/min的速度震荡24‑72h。(2)与离子表面活性剂在温度为37‑40℃、转速为50‑300rpm/min的条件下振荡3‑6h得到第二软骨。(3)、与胰酶以及核酸酶在温度为37‑40℃、转速为50‑300rpm/min的条件下振荡0.5‑2h。(4)、先在紫外线下照射1‑3h后，再浸入交联剂中反应2‑6h。此制备方法得到的脱细胞软骨基质无毒、生物相容性好、不破坏关节软骨本身的结构，具有与宿主骨质高度的同源性，利于新生成骨细胞粘附、增殖并发挥成骨作用。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞软骨基质及其制备方法
本专利技术涉及关节软骨
，具体而言，涉及一种细胞软骨基质及其制备方法。
技术介绍
关节在人体中的作用十分重要，主要是承载负荷、减轻震荡、减少关节间骨骼摩擦等，但因关节软骨结构中缺乏血管、神经及淋巴组织，且软骨细胞本身又是高度分化的组织细胞，自身修复能力极为有限。并且随着人类社会老龄化速度的加快，由各种外伤和退行性变引起的关节软骨损伤患者在骨科中正呈现逐渐增多的趋势。目前临床常用外科手术移植对软骨损伤进行治疗和修复。作为软骨组织工程载体支架制备材料为人工合成材料，其亲水性不够，对细胞粘附性较弱，并且降解产物偏酸性，引起炎症反应，不利于细胞的生长且大多来源进口，价格昂贵，使其应用收到了一定的限制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种脱细胞软骨基质的制备方法，此制备方法简单，得到的脱细胞软骨基质无毒、生物相容性好、不破坏关节软骨本身的结构，具有与宿主骨质高度的同源性，利于新生成骨细胞粘附、增殖并发挥成骨作用。本专利技术的另一目的在于提供一种上述脱细胞软骨基质的制备方法制备得到的脱细胞软骨基质，无毒、生物相容性好、不破坏关节软骨本身的结构，具有与宿主骨质高度的同源性，利于新生成骨细胞粘附、增殖并发挥成骨作用。本专利技术是采用以下技术方案实现的：一种脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：(1)、对关节软骨杀菌，除去关节软骨上的软骨膜，在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以50-300rpm/min的速度震荡24-72h得到第一软骨。(2)、第一软骨与离子表面活性剂在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡3-6h得到第二软骨。(3)、第二软骨与胰酶以及核酸酶在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡0.5-2h，得到脱细胞关节软骨支架。(4)、将脱细胞关节软骨支架先在紫外线下照射1-3h后，再浸入交联剂中反应2-6h后，最后进行干燥得到。进一步地，本专利技术较佳的实施例中，上述杀菌按照如下方式进行：将关节软骨放入3-6℃的无菌青链霉素中浸泡2-8h。进一步地，本专利技术较佳的实施例中，上述低渗溶液选自质量浓度为0.5％-1％的TritonX-100和质量浓度为0.5％-1％的Tris-HCl中的至少一种。进一步地，本专利技术较佳的实施例中，上述离子表面活性剂是质量浓度为0.5％-2％的SDS或APG。进一步地，本专利技术较佳的实施例中，上述胰酶1-10u/ml的胰酶；核酸酶为50-100u/ml的DNA核酸酶和1-10u/ml的RNA核酸酶。进一步地，本专利技术较佳的实施例中，上述步骤(4)中，紫外照射之前，将脱细胞关节软骨支架置于聚乙烯模具中成型。进一步地，本专利技术较佳的实施例中，上述紫外线的波长为240-250nm，聚乙烯模具距离紫外线发光装置的距离为10-30cm。进一步地，本专利技术较佳的实施例中，上述步骤(4)中，交联剂为：将碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺中的至少一种溶于乙醇中得到的混合溶液；乙醇与混合溶液的体积百分比为40％-95％。进一步地，本专利技术较佳的实施例中，上述干燥的方式为冷冻干燥。一种上述脱细胞软骨基质的制备方法制备得到的脱细胞软骨基质。本专利技术的较佳实施例提供的脱细胞软骨基质的制备方法的有益效果是：对关节软骨杀菌，避免其遭到污染，避免传染增殖，除去关节软骨上的软骨膜，得到的是软骨组织，软骨组织在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒，不仅使后续的各种处理更加充分，且使性质活泼的基团外露，增大了接触面积，以50-300rpm/min的速度震荡24-72h得到第一软骨，释放出细胞内的核物质，脱去细胞，避免引起免疫排斥反应。第一软骨与离子表面活性剂在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡3-6h得到第二软骨，破坏第一软骨内的细胞膜和脂蛋白，去除油脂。第二软骨与胰酶以及核酸酶在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡0.5-2h，得到脱细胞关节软骨支架，水解脂肪及核酸物质，去除软骨中的细胞成分，经过了脱细胞处理，在具备低抗原性的同时，仍保留了Ⅱ型胶原和糖胺多糖等细胞外基质成分。将脱细胞关节软骨支架先在紫外线下照射1-3h后，再浸入交联剂中反应2-6h后，进行物理交联和化学交联，紫外照射和无毒的交联剂对支架进行交联使其具有了一定的力学强度，使支架更为稳定。最后进行干燥，进一步降低了组织的免疫源性，具备了良好的安全性，无毒、无疾病传播的风险，同时保留了软骨天然结构，使其具有合适的孔径、孔隙率，有利于营养物质的进入及代谢废物的排出，且便于支架产品的长期保存和运输。本专利技术提供的上述脱细胞软骨基质的制备方法制备得到的脱细胞软骨基质，无毒、生物相容性好、不破坏关节软骨本身的结构，具有与宿主骨质高度的同源性，利于新生成骨细胞粘附、增殖并发挥成骨作用。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例的细胞软骨基质及其制备方法进行具体说明。一种脱细胞软骨基质的制备方法，包括如下步骤：(1)、对关节软骨杀菌，除去关节软骨上的软骨膜，在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以50-300rpm/min的速度震荡24-72h得到第一软骨。具体地，关节软骨为异种关节软骨，即为非人的关节软骨，如：猪、兔和犬等的关节软骨，使用的是天然关节软骨，易于获取，可以与患者的骨质保持高度的同源性，减小患者使用后的排异反应。杀菌按照如下方式进行：将关节软骨放入3-6℃的无菌青链霉素中浸泡2-8h，避免其遭到污染，避免传染增殖。其中，青链霉素为100-500u/ml的青霉素和100-500u/ml的链霉素，青霉素和链霉素的体积比为1:0.5-1.5，其消毒杀菌的效果更好。杀菌以后，需要对其进行超声PBS冲洗3-5遍，每遍30-90min。除去关节软骨表面残留的试剂，对其进行清洗。本专利技术中，PBS溶液是一种磷酸缓冲盐溶液，一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。除去关节软骨上的软骨膜，得到的是软骨组织，优选，使用无菌剪刀去除关节软骨上的软骨膜，软骨膜去除的较为干净，避免其遭到细菌污染，避免传染增殖。在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒，使关节软骨细胞裂解，不仅使后续的各种处理更加充分，且使性质活泼的基团外露，增大了接触面积。以50-300rpm/min的速度震荡24-72h得到第一软骨，释放出细胞内的核物质，脱去细胞，避免引起免疫排斥反应。震荡速度过快，粉碎效果不好，脱去细胞的效果不好，震荡速度过慢，关节软骨内的基团与低渗溶液的接触效果不好，细胞裂解的效果不好。震荡时间过长，造成资源的浪费，震荡时间过短，脱除细胞的效果不好。在此震荡速度、震荡时间的条件下进行，关节软骨的脱细胞效果更好，使得到脱细胞软骨基质的的生物相容性更好，不会发生排斥反应。优选地，低渗溶液选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脱细胞软骨基质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)、对关节软骨杀菌，除去所述关节软骨上的软骨膜，在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以50‑300rpm/min的速度震荡24‑72h得到第一软骨；(2)、所述第一软骨与离子表面活性剂在温度为37‑40℃、转速为50‑300rpm/min的条件下振荡3‑6h得到第二软骨；(3)、所述第二软骨与胰酶以及核酸酶在温度为37‑40℃、转速为50‑300rpm/min的条件下振荡0.5‑2h，得到脱细胞关节软骨支架；(4)、将所述脱细胞关节软骨支架先在紫外线下照射1‑3h后，再浸入交联剂中反应2‑6h后，最后进行干燥得到。

【技术特征摘要】
1.一种脱细胞软骨基质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)、对关节软骨杀菌，除去所述关节软骨上的软骨膜，在低渗溶液中粉碎成软骨颗粒后以50-300rpm/min的速度震荡24-72h得到第一软骨；(2)、所述第一软骨与离子表面活性剂在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡3-6h得到第二软骨；(3)、所述第二软骨与胰酶以及核酸酶在温度为37-40℃、转速为50-300rpm/min的条件下振荡0.5-2h，得到脱细胞关节软骨支架；(4)、将所述脱细胞关节软骨支架先在紫外线下照射1-3h后，再浸入交联剂中反应2-6h后，最后进行干燥得到。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述杀菌按照如下方式进行：将所述关节软骨放入3-6℃的无菌青链霉素中浸泡2-8h。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述低渗溶液选自质量浓度为0.5％-1％的TritonX-100和质量浓度为0.5％-1％的Tris-HCl中的至少一种。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建鑫，周新钦，杨帅，王川，朱天钢，刘尧，李恒，
申请(专利权)人：河南汇博医疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41