RNAi诱导的亨廷顿蛋白基因抑制制造技术

本发明专利技术提供了包含第一RNA序列和第二RNA序列的双链RNA，其中第一RNA序列和第二RNA序列基本互补，其中第一RNA序列具有至少19个核苷酸的序列长度并且与SEQ NO.1基本互补。所述双链RNA用于诱导针对亨廷顿蛋白外显子1序列的RNAi。本发明专利技术的双链RNA能够减少动物模型中的神经元细胞死亡和亨廷顿蛋白聚集体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】RNAi诱导的亨廷顿蛋白基因抑制
技术介绍
亨廷顿蛋白基因也被称为HTT或HD(亨廷顿舞蹈病)基因，编码亨廷顿蛋白。亨廷顿蛋白基因是约13.5kb的大基因(亨廷顿蛋白约350kDa)。亨廷顿舞蹈病是亨廷顿蛋白基因中的基因突变引起的遗传性神经变性疾病。基因突变涉及亨廷顿蛋白基因中被称为CAG三核苷酸重复的DNA片段。通常，人亨廷顿蛋白基因中的CAG片段重复多次，即约10-35次。患上亨廷顿舞蹈病的人在至少一个等位基因中有扩大数量的CAG重复。患病的人通常从一位患病的父母遗传了突变的等位基因。在极少数情况下，患有亨廷顿舞蹈病的个体的父母均不患有该病(散发性HD)。具有36-39个CAG重复的人可能会出现亨廷顿舞蹈病的病征和症状，而具有40个或更多CAG重复的人几乎总是会罹患这种疾病。CAG重复的尺寸的增加导致生成延长的(突变的)亨廷顿蛋白。该蛋白在细胞中被加工成较小的片段，该较小的片段具有细胞毒性并在神经元中积累和聚集。这会破坏神经元的正常功能并导致神经元的最终死亡。这是在脑部发生的引起亨廷顿舞蹈病的病征和症状的过程。RNA干扰(RNAi)是一种涉及序列特异性下调mRNA的天然存在的机制。mRNA的下调导致表达的蛋白质的量减少。RNA干扰是由双链RNA引发的。双链RNA的一条链与其靶标，即mRNA，基本上或完全互补。该链被称为引导链。RNA干扰的机制涉及引导链并入RNA诱导的沉默复合体(RISC)。该复合体是通过互补碱基配对结合其靶mRNA的多转换(multipleturnover)复合体。一旦结合到其靶mRNA，它可以切割mRNA或降低翻译效率。RNA干扰自发现以来被广泛用于敲减特定的靶基因。已经使用的诱导RNA干扰的触发因素包括使用小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。此外，天然触发RNAi的分子，即所谓的小分子RNA(miRNA)，已被用于制造模仿其天然存在的对应物的人工miRNA。这些策略的共同之处在于，它们提供了被设计为靶向所选择的基因的、基本上双链的RNA分子。利用RNAi的序列特异性模式的基于RNAi的治疗方法正在开发中，并且有几种目前正在进行临床试验(参见i.a.Davidson和McCray,NatureReviews-Genetics,2011；Vol.12；329-340)。由于亨廷顿舞蹈病涉及突变亨廷顿蛋白的表达，其积累导致疾病发生，而RNA干扰提供了治疗该疾病的机会，因为它可以降低亨廷顿蛋白基因的表达。基于这种方法的范例涉及减少突变Htt蛋白，以由此减少由突变Htt蛋白产生的毒性作用，从而实现亨廷顿舞蹈病症状的减少和/或延迟，或者甚至完全预防亨廷顿舞蹈病症状。在现有技术中靶向亨廷顿蛋白基因抑制被假设为包括列出大约两千个假设的siRNA靶序列(WO2005105995)。降低亨廷顿蛋白基因表达的策略是本领域已知的，并涉及特异性靶向突变的亨廷顿蛋白基因(例如US20090186410，US20110172291)。或者，也已经使用RNA干扰来靶向突变基因和非突变基因(例如，Rodriguez-Lebronetal.,2005,MolTher.Vol12No.4:618-633；Franichetal.,2008,MolTher,Vol.16No.5；947-956；Drouetetal.,2009,AnnalsofNeurology；Vol.65No.3；276-285以及McBrideetal.MolTher.2011Dec；19(12):2152-62；US20080015158,WO2008134646)。在后一种情况下，证明了野生型亨廷顿蛋白质的敲减不具有任何明显的不利影响。
技术实现思路
本专利技术提供了包含第一RNA序列和第二RNA序列的双链RNA，其中第一RNA序列和第二RNA序列基本互补，其中第一RNA序列具有至少19个核苷酸的序列长度并且与SEQIDNo.1基本互补。测试大量靶序列以有效敲减亨廷顿蛋白基因。发现本专利技术选择的双链RNA可有效降低亨廷顿蛋白基因表达。当直接通过转染或间接通过DNA的递送(例如转染)或通过载体介导的表达(由此可表达所述双链RNA)将所述双链RNA提供于细胞中时，所述双链RNA能够降低突变型亨廷顿蛋白基因和正常的亨廷顿蛋白基因的表达。此外，证明了当本专利技术的双链RNA作为siRNA提供或于miRNA支架中提供时，其能够降低靶基因表达。当在动物模型中测试时，证明了本专利技术的双链RNA能够减少神经元细胞死亡和亨廷顿蛋白聚集体。本专利技术提供的双链RNA与本领域中靶向亨廷顿蛋白基因的双链RNA相比有改进，或至少提供了其替代方案。本专利技术的双链RNA可以作为siRNA、shRNA、pre-miRNA(pre-miRNA)或pri-miRNA(pri-miRNA)提供。这样的双链RNA可被直接递送到靶细胞，例如，通过使用例如转染方法的细胞摄取。优选地，使用基因治疗载体实现所述递送，其中siRNA、shRNA、pre-miRNA或pri-miRNA的表达盒包括在载体中。这样，可以恒定地为细胞供应双链RNA，以实现持久的亨廷顿蛋白基因抑制而不需要重复给药。优选地，所选择的病毒载体是AAV5。因此，本专利技术还提供了本专利技术的双链RNA的医疗用途(例如治疗亨廷顿舞蹈病)，其中此类医疗用途还可以包括能够表达本专利技术的所述双链RNA的表达盒或病毒载体，例如AAV5。附图说明图1为人亨廷顿蛋白(HTT)基因和靶序列。(A)具有CAG扩增(黑色)和miH1-H21的靶序列(浅灰色)的人HTT基因(L27350.1)的示意图；(B)HTT基因的外显子1RNA序列(SEQIDNO.2)。CAG重复序列为核苷酸367-429。(C)测试的外显子1的靶序列的示意图(H1，185-205；H2，186-206；H3，189-209；H4，191-211；H5，194-214；H6，196-216；H7，250-270；H8，261-281，H9，310-330；H10，311-331，H11，339-359，H12，345-365，H13，454-474；H14，459-479；H15，477-497；H16，486-506；H17，492-512；H18，498-518；H19，549-569；H20，557-577；H21，558-578，H1-H21对应于SEQIDNO.23-43)。所示出的序列是DNA序列。数字是指SEQIDNO.2中相应的RNA核苷酸序列。除DNA编码“t”而RNA编码“U”之外，SEQIDNO.2的相应RNA靶序列具有C)中所列的序列。图2.双链RNA和表达盒的实例。(A)具有所示miH12引导序列(灰色)的miH12pre-miH12-155(SEQIDNO.44)和pre-miH12-451支架(SEQIDNO.45)的pri-miRNA/pre-miRNA支架的实例。(B)本专利技术的双链RNA以及它们是如何被RNAi机制加工的示意图。双链RNA可以是短发夹RNA(1)或延伸的siRNA(2)。发夹RNA或延伸的siRNA在近端具有第一RNA序列，如图所示(用1和括号表示)。短发夹RNA或延伸的siRNA可以在细胞中通过RNAi机制来加工以产生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双链RNA，其包含第一RNA序列和第二RNA序列，其中所述第一RNA序列和第二RNA序列基本互补，其中所述第一RNA序列具有至少19个核苷酸的序列长度，并且与SEQ ID NO.1基本互补。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.24 EP 14200308.61.一种双链RNA，其包含第一RNA序列和第二RNA序列，其中所述第一RNA序列和第二RNA序列基本互补，其中所述第一RNA序列具有至少19个核苷酸的序列长度，并且与SEQIDNO.1基本互补。2.根据权利要求1所述的双链RNA，其中所述双链RNA能够降低亨廷顿蛋白基因表达。3.根据权利要求1或2所述的双链RNA，其中所述双链RNA包含在pre-miRNA支架、pri-miRNA支架、shRNA或siRNA内，优选包含在pre-miRNA支架内。4.根据权利要求1-3中任一项所述的双链RNA，其中所述第一RNA序列具有至少20个核苷酸、优选至少21个核苷酸的序列长度。5.根据权利要求1-4中任一项所述的双链RNA，其中所述第一RNA序列与SEQIDNO.1完全互补。6.根据权利要求1-5中任一项所述的双链RNA，其中第一链选自SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6和SEQIDNO.7。7.根据权利要求1-6中任一项所述的双链RNA，其中第一链和第二链选自以下组合：SEQIDNO.3和SEQIDNO.8；SEQIDNO.4和SEQIDNO.9；SEQIDNO.5和SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：帕夫林纳斯蒂芬诺娃·康斯坦丁诺娃，亚娜·米尼亚利柯娃，
申请(专利权)人：尤尼克尔生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL