肝癌血清标志物CCT3制造技术

本发明专利技术涉及CCT3的一种新用途，即作为肝癌血清标志物。其优点表现在：本发明专利技术发现，在肝癌中，CCT3表达受YAP调控；肝癌患者血清CCT3水平较高，且更高的CCT3浓度与肝癌中更高的肿瘤分期显著相关；肝癌患者血清CCT3水平与甲胎蛋白AFP、谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST成正相关关系。本发明专利技术发现血清CCT3预测肝癌的最佳诊断阈值为79pg/ml，灵敏度为94.5％，特异性为97.6％，说明血清CCT3是肝癌中优于AFP的肿瘤标志物。

【技术实现步骤摘要】
肝癌血清标志物CCT3
本专利技术涉及检验医学
，具体地说，是一种新的肝癌血清标志物。
技术介绍
含有TCP1复合物的Te伴侣蛋白(CCT)，可介导细胞质中的蛋白折叠。伴侣蛋白是存在于所有生物中的ATP依赖性蛋白折叠机器。它们由两个背对背堆叠的寡聚环组成，每个末端有一个空腔，在这个空腔中发生蛋白质底物结合和折叠。Te伴侣蛋白家族包括线粒体热休克蛋白60，质体Rubisco亚基结合蛋白和古细菌II组伴侣蛋白等。CCT3是CCT复合物中的关键组成部分，其在蛋白质折叠或重折叠期间起重要作用。我们通过生物信息学预测分析CCT3可能是肝癌促癌蛋白YAP的关键靶蛋白。然而，CCT3是否可作为肝癌中的新型血清肿瘤标志物仍然未知。目前，血清中肿瘤标志物检测如甲胎蛋白(AFP)已用于肿瘤早期诊断、评估预后及观察疗效复发及转移等方面。中国专利文献CN107604062A公开了一种用于肝癌免疫治疗的多抗原检测方法，并公开了CCT3为肝癌肿瘤抗原基因。但是关于本专利技术的CCT3作为肝癌的血清肿瘤标志物目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供CCT3的一种新用途。本专利技术的第二个目的是，提供一种诊断肝癌或对肝癌分期的试剂盒。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：CCT3蛋白作为肝癌的诊断标志物的应用。CCT3蛋白作为肝癌的血清标志物的应用。CCT3蛋白作为标志物在制备诊断肝癌的检测产品中的应用。CCT3蛋白作为标志物在制备对肝癌分期的检测产品中的应用。CCT3蛋白作为血清标志物。所述的检测产品检测血清。所述的检测产品为诊断试剂盒。CCT3蛋白作为唯一的标志物。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种诊断肝癌或对肝癌分期的试剂盒，所述的试剂盒包含特异性检测血清CCT3蛋白的试剂。本专利技术优点在于：1、本专利技术发现，在肝癌中，CCT3表达受YAP调控；肝癌患者血清CCT3水平较高，且更高的CCT3浓度与肝癌中更高的肿瘤分期显著相关；肝癌患者血清CCT3水平与甲胎蛋白AFP、谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST成正相关关系。2、本专利技术发现血清CCT3预测肝癌的最佳诊断阈值为79pg/ml，灵敏度为94.5％，特异性为97.6％，说明血清CCT3是肝癌中优于AFP的肿瘤标志物。附图说明附图1：CCT3受促肝癌蛋白YAP调控。附图2：CCT3在肝癌中表达特异性上升。图2B中，*与肝癌组相比p＝0.000。附图3：血清CCT3与AFP，ALT以及AST呈正相关关系。附图4：血清CCT3肝癌诊断性能优于AFP。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。标本收集所有标本收集于上海市瑞金医院2015年3月至2017年3月期间。肝癌患者平均年龄为55.27±7.73岁，男女比例2.34:1，乙型肝炎患者平均年龄，37.46±6.43岁；男女比例1.35:1，丙型肝炎患者平均年龄，57.37±10.93岁；男女比例1.31:1，肝硬化患者平均年龄57.64±9.69岁；男女比例为2.39:1，结肠癌患者平均年龄55.45±13.58岁，男女比例3.41:1，肺癌患者平均年龄51.52±2.54岁，男女比例4.4:1，胃癌患者平均57.12±10.44岁，男女比例3.8:1，乳腺癌患者平均年龄37.66±15.61岁；均为女性患者。所有患者均获得知情同意书。通过计算机断层扫描和磁共振成像确认肝癌诊断结果。进行组织病理学分析以确认患者患有结肠癌，胃癌，乳腺癌和肺癌。乙型或丙型肝炎患者分别在血清中检测到超过1×103拷贝的乙肝病毒或丙肝病毒DNA(科华，上海，中国)。同时在2015年3月至2017年3月，在上海瑞金医院招募了200名健康志愿者(平均年龄为54.42±14.08岁，男女比例为1.31:1)作为对照组。转移性肝肿瘤患者不包括在本研究中。采用自动生化分析仪测定肝功能指标谷草转氨酶AST和谷丙转氨酶ALT。研究方案根据1975年赫尔辛基宣言的伦理准则进行。细胞购买肝癌细胞系和正常肝细胞均购自中科院细胞库。免疫印迹实验将细胞蛋白裂解物在SDS聚丙烯酰胺凝胶中分离并转移到硝酸纤维素膜上。将膜在封闭缓冲液(含0.5％吐温的Tris缓冲盐水中的5％牛奶)中封闭，然后用特异性抗体孵育。所使用的一抗是抗GAPDH[CellSignalingTechnology(CST)，Boston，MA，#5174]，抗-TEAD(Abcam，#ab197589)，抗-CCT3(Abcam，#ab225878)，抗YAP(Abcam，#ab52771)，抗TFCP2(Abcam，#ab80445)。酶联免疫吸附试验(ELISA)进行酶联免疫吸附试验以评估血清AFP和CCT3的浓度。将血清样品在稀释缓冲液中稀释(1：4)，并将50μl稀释的样品/孔加入到96孔微量滴定板中进行AFP和CCT3浓度分析。ELISA试剂盒购自LichenBiotech有限公司(中国上海)。严格按照制造商的指导原则进行分析。通过测量450nm处的吸光度来确定信号。统计分析采用独立样本t检验，方差分析，Kruskal-Wallis检验比较组间连续变量差异。进行Spearman等级相关检验以计算等级变量之间的相关系数。使用ROC曲线下面积(AUC-ROC)评估CCT3，AFP以及CCT3和AFP联合预测肝癌的诊断价值。我们并通过ROC曲线确定了诊断阈值。P<0.05被认为有显著统计学意义。实施例1：CCT3表达受YAP调控在高致癌性肝癌细胞系Bel-7402中过表达YAP后，我们发现CCT3表达水平显著上升(图1A)。此外，在肝癌细胞系Bel-7402和SMMC-7721中敲减YAP后，我们发现CCT3表达水平显著下降(图1B)。我们同时发现YAP和CCT3之间的相互作用(图1C)。证明在肝癌中，CCT3表达受YAP调控。实施例2：肝癌患者血清CCT3水平较高使用免疫印迹分析肝癌患者和健康个体的血清样品的蛋白表达水平。抗CCT3抗体在肝癌患者的血清样品中发现到61kDa的特异性条带，并且在健康个体中没有检测到相似的条带(图2A)。我们在血清样品中没有检测到YAP及其相关的其他蛋白例如TEAD以及TFCP2，证明尽管这些YAP相关蛋白在肝癌发展中起关键作用，但它们不能用作肝肿瘤标志物。我们还测量了健康人和其他肝病(包括乙肝/丙肝和肝硬化)，其他类型的消化系统癌症(包括结肠癌和胃癌)以及乳腺癌和肺癌患者血清中CCT3的浓度，以确认是否CCT3在肝癌患者血清中特异性升高。结果表明肝癌患者血清CCT3浓度(705.464±660.223pg/ml，n＝204)显著高于健康个体(38.442±12.041pg/ml，n＝200，p＝0.000)，乙型肝炎患者(43.322±19.105pg/ml，n＝53，p＝0.000)，丙肝患者(49.409±17.027pg/ml，n＝56，p＝0.000)，肝硬化患者(35.414±20.112pg/ml，n＝53，p＝0.000)，胃癌患者(42.475±21.607pg/ml，n＝52，p＝0.000)，结肠癌患者(43.844±26.929pg/ml，n＝50，p＝0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
CCT3蛋白作为肝癌的诊断标志物的应用。

【技术特征摘要】
1.CCT3蛋白作为肝癌的诊断标志物的应用。2.CCT3蛋白作为肝癌的血清标志物的应用。3.CCT3蛋白作为标志物在制备诊断肝癌的检测产品中的应用。4.CCT3蛋白作为标志物在制备对肝癌分期的检测产品中的应用。5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，CCT3蛋白作为血清标志物。6.根据权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：王佳谊，张骁，刘雅，孙奋勇，陈岩，潘秋辉，
申请(专利权)人：上海市第十人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31