【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，尤其涉及一段具核梭杆菌特异性dna序列及其应用和检测方法。
技术介绍
1、肠道菌群在人体疾病中发挥重要作用。肠道菌群中梭杆菌(fusobacterium)的失衡与多种疾病发生发展密切相关。临床研究表明肠道中具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum)的富集与大肠癌(colorectal cancer，crc)发生发展有高度相关性。近期研究进一步表明具核梭杆菌是重要的crc致病菌，其对crc肿瘤细胞中关键促癌分子有重要调节作用，促进肿瘤侵袭和迁移；还可激活肿瘤细胞自噬，导致crc化疗耐药；其对免疫微环境也有重要调节作用，可通过诱导巨噬细胞表达趋化因子促进肿瘤转移。crc患者肿瘤组织及粪便中，具核梭杆菌显著升高的丰度与不良预后和复发呈现相关性。此外，炎症性肠病中还发现具核梭杆菌可分泌外膜囊泡进而促进肠道炎症。
2、目前肠道中具核梭杆菌定量pcr检测所依赖的引物并不特异，对f.periodonticum、f.pseudoperiodonticum、f.hwasookii等亲缘较近菌种有非特异性扩增，影响结果准确性。因此，仍缺乏一种较为精准的具核梭杆菌pcr检测方法，精确测定肠道中具核梭杆菌的丰度对了解其分布以及与疾病的确切关联至关重要。
3、目前最为广泛使用的具核梭杆菌检测引物为靶向nusg基因的fn-f/r(genomeres2012,22:299-306)，此外也有报道采用靶向16s rrna基因和fada基因的引物(ann clinbiochem 2022,59:39
4、因此，针对具核梭杆菌仍缺乏一种精准的pcr检测方法，急需开发一组可精确检测具核梭杆菌的引物。
技术实现思路
1、为了克服现有技术中存在的至少一个问题，本专利技术筛选了一段对具核梭杆菌有高度特异性的dna序列，设计了相应的检测引物，并阐述了其应用于具核梭杆菌检测的准确性。本专利技术有助于精确揭示病灶中具核梭杆菌丰度及其与疾病间的确切关系。
2、需要注意的是，具核梭杆菌有高度遗传多样性，其4个亚种目前已被重新定义为独立的菌种，并命名为动物梭杆菌(原动物亚种)、多形梭杆菌(原多形亚种)、文氏梭杆菌(原文氏亚种)和具核梭杆菌(原具核亚种)。但为与既往研究一致，本专利技术下文中所述的“具核梭杆菌”这一名称仍泛指这4个新定义菌种(原4个亚种)的集合，而非指新定义的具核梭杆菌菌种(原“具核亚种”)。
3、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
4、本专利技术的第一个方面是提供一段具核梭杆菌特异性dna序列，其如seq id no.1所示或为与seq id no.1所示序列具有85-99％相似性的同源序列。
5、可理解的是，dna序列存在不可避免的多态性，无法穷举，但考虑到其同源片段未在其他物种中发现，对具核梭杆菌均呈现高度特异性，因此，，此处所指的dna特征性序列包含seq id no.1所示序列及与seq id no.1所示序列具有核苷酸序列相似性的未列出的片段。
6、进一步地，所述特异性dna序列的筛选方法包括步骤：对具核梭杆菌进行泛基因组分析，通过序列比对筛选出具核梭杆菌中在核苷酸序列水平高度保守的基因；再通过比对从中筛选出与其他梭杆菌和其他物种在核苷酸水平无同源性的基因(即对具核梭杆菌保守且特异的基因)；将所得基因序列与非梭杆菌物种进行核苷酸序列比对，进一步剔除与其他物种具有一定序列相似性的基因，并排除含有插入、截断以及拷贝数在菌株间不一致的基因，从而筛选获得所述特异性dna序列(命名为fn-sr)。
7、进一步地，所述在核苷酸序列水平高度保守的基因为在超过98％具核梭杆菌基因组中都存在，且菌株间该基因核苷酸序列一致性均不低于85％。
8、进一步地，所述与其他物种具有一定序列相似性的基因为具有较高序列相似性的基因，具体地，所述序列相似性为>60％。
9、本专利技术的第二个方面是提供一种引物组合物，其用于扩增第一方面中任一所述的具核梭杆菌特异性dna序列。具体地，在上述筛选的特异性dna序列的基础上，对其对应的所有已知序列进行多序列比对，在相对保守的区域设计一组通用扩增引物。
10、进一步地，所述引物组合物包括：如seq id no.2所示序列的正向引物、如seq idno.3～seq id no.5所示序列的反向引物。
11、可理解的是，上述列出的引物组合物仅为一种应用示例，基于本专利技术描述的具核梭杆菌特异性片段所对应序列设计出的用于本专利技术所描述目的的引物或探针均属于本专利技术的保护范畴。
12、进一步地，由于目标区域存在不可避免的序列多态性，所设计的引物包括1条含兼并碱基的正向引物和3条含兼并碱基的反向引物，四条引物需要同时混合作为一组引物使用。简并碱基表示为：r：a/g；y：c/t；m：a/c；k：g/t；s：c/g；w：a/t；h：a/c/t；b：c/g/t；v：a/c/g；d：a/g/t；n：a/c/g/t。
13、进一步地，在具体验证实施例中，所述引物组合物在测试菌株中的特异性和敏感性可达100％。
14、本专利技术的第三个方面是提供一种具核梭杆菌的检测试剂，其包含第二方面中任一所述的引物组合物和pcr扩增试剂。具体地，pcr扩增试剂包括普通pcr扩增试剂或实时定量pcr扩增试剂。
15、上述特异性序列及其对应的引物序列如下表所示：
16、表1-具核梭杆菌特异性dna序列及其检测引物
17、
18、
19、本专利技术的第四个方面是提供一种第一方面中任一所述的具核梭杆菌特异性dna序列、第二方面中任一所述的引物组合物、或第三方面中任一所述的的检测试剂的应用，其选自以下应用中的至少一种：在基于非诊断目的检测具核梭杆菌中的应用、在制备检测具核梭杆菌的试剂盒中的应用、在制备早期检测结直肠癌或炎症性肠病的试剂盒中的应用、在生物信息学分析中的应用、在评估结直肠癌不良预后和复发中的应用。
20、进一步地，所述生物信息学分析包括：通过序列比对鉴定已测序梭杆菌菌株是否为具核梭杆菌；或在宏基因组本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一段具核梭杆菌特异性DNA序列，其特征在于，所述特异性DNA序列如SEQ ID No.1所示或为与SEQ ID NO.1所示序列具有85-99％相似性的同源序列。
2.根据权利要求1所述的具核梭杆菌特异性DNA序列，其特征在于，，所述特异性DNA序列的筛选方法包括步骤：对具核梭杆菌进行泛基因组分析，，通过序列比对筛选出具核梭杆菌中在核苷酸序列水平高度保守的基因；再通过比对从中筛选出与其他梭杆菌和其他物种在核苷酸水平无同源性的基因；将所得基因序列与非梭杆菌物种进行核苷酸序列比对，进一步剔除与其他物种具有一定序列相似性的基因，并排除含有插入、截断以及拷贝数在菌株间不一致的基因，从而筛选获得所述特异性DNA序列。
3.一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物用于扩增如权利要求1所述的具核梭杆菌特异性DNA序列。
4.根据权利要求3所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括：如SEQ IDNo.2所示序列的正向引物、如SEQ ID No.3～SEQ ID No.5所示序列的反向引物。
5.一种具核梭杆菌的检测试剂，其特征在于，所
6.一种如权利要求1所述的具核梭杆菌特异性DNA序列、如权利要求3所述的引物组合物、或如权利要求4所述的检测试剂的应用，其特征在于，所述应用选自以下应用中的至少一种：在基于非诊断目的检测具核梭杆菌中的应用、在制备检测具核梭杆菌的试剂盒中的应用、在制备早期检测结直肠癌或炎症性肠病的试剂盒中的应用、在生物信息学分析中的应用、在评估结直肠癌不良预后和复发中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生物信息学分析包括：通过序列比对鉴定已测序梭杆菌菌株是否为具核梭杆菌；或在宏基因组测序数据分析中检测分析具核梭杆菌的存在情况。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为含有所述引物组合物的普通PCR试剂盒或实时定量PCR试剂盒。
9.一种如权利要求1所述的具核梭杆菌特异性DNA序列的检测方法，其特征在于，包括步骤：将待检测样本采用如权利要求3所述的引物组合物进行PCR扩增，对所得扩增产物进行分析和鉴定从而进行所述特异性DNA序列的检测。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述待检侧样本为单一菌株样本或含混合菌体样本，所述待检侧样本包括全血样本、粪便样本、组织样本。
...【技术特征摘要】
1.一段具核梭杆菌特异性dna序列，其特征在于，所述特异性dna序列如seq id no.1所示或为与seq id no.1所示序列具有85-99％相似性的同源序列。
2.根据权利要求1所述的具核梭杆菌特异性dna序列，其特征在于，，所述特异性dna序列的筛选方法包括步骤：对具核梭杆菌进行泛基因组分析，，通过序列比对筛选出具核梭杆菌中在核苷酸序列水平高度保守的基因；再通过比对从中筛选出与其他梭杆菌和其他物种在核苷酸水平无同源性的基因；将所得基因序列与非梭杆菌物种进行核苷酸序列比对，进一步剔除与其他物种具有一定序列相似性的基因，并排除含有插入、截断以及拷贝数在菌株间不一致的基因，从而筛选获得所述特异性dna序列。
3.一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物用于扩增如权利要求1所述的具核梭杆菌特异性dna序列。
4.根据权利要求3所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括：如seq idno.2所示序列的正向引物、如seq id no.3～seq id no.5所示序列的反向引物。
5.一种具核梭杆菌的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包含如权利要求3或4所述的引物组合物和pcr扩增试剂。
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