一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法，包括以下步骤：1）设计合成嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶基因，并插入pET28表达载体，构建DNA连接酶的重组表达质粒；2）重组表达嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶；3）嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶亲和纯化；4）检测嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶活性温度依赖性。本发明专利技术一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法制备的低温型尿嘧啶DNA糖苷酶来源于低温微生物，在20‑25度表现最高的酶活性，而在50度加热5分钟即完全失活，显著改善了PCR的交叉污染防治效果。

Preparation of an uracil DNA glucosidase at low temperature

The invention discloses a preparation method of low temperature uracil DNA glucosidase, including the following steps: 1) design and synthesize the eosinophil Colwellia psychrerythraea uracil DNA glucosidase gene, insert the pET28 expression vector, construct the recombinant expression plasmid of the DNA ligase, and recombine the expression of the eosinophil Colwellia psychrerythraea Uracil DNA glycosidase; 3) Colwellia psychrerythraea uracil DNA glycosinase affinity purification; 4) detection of the temperature dependence of Colwellia psychrerythraea uracil DNA glucosidase activity of eosinophilic bacteria. The preparation of a low temperature uracil DNA glucosidase produced by the preparation method of low temperature uracil DNA glycosidase is derived from low temperature microorganism, with the highest enzyme activity at 20 25 degrees, and completely deactivated at 50 degree heating for 5 minutes, which significantly improves the effect of the cross contamination prevention and control of PCR.

【技术实现步骤摘要】
一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法
本专利技术涉及一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法。
技术介绍
目前PCR交叉污染防治中添加的尿嘧啶DNA糖苷酶来源于常温微生物，其在低温下的失活效果不明显，只能在高温加热才能失活，导致PCR过程中目的基因扩增产量低，使得基于PCR的核酸检测灵敏度降低。目前PCR中添加的尿嘧啶DNA糖苷酶来源于常温微生物，其只能在30-40度具有最高活性，同时只有在70度以上才失活。
技术实现思路
本专利技术针对现有PCR检测中添加的尿嘧啶DNA糖苷酶的缺陷，开发了一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法，该方法制备出了在低温发挥活性的尿嘧啶DNA糖苷酶，该尿嘧啶DNA糖苷酶来自于嗜冷微生物Colwelliapsychrerythraea，并经过基因改造，使得其在20-25度的温度范围内，能够有效发挥最高活性，而在高温迅速丧失活性。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是设计一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法，包括以下步骤：步骤一、设计合成嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶基因，并插入pET28表达载体，构建DNA连接酶的重组表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一、设计合成嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶基因，并插入pET28表达载体，构建DNA连接酶的重组表达质粒；重组嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶N端带有来源于pET28载体的6个连续组氨酸亲和纯化标签，用于固定化镍离子亲和层析纯化；步骤二，重组表达嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶；将嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21（...

【技术特征摘要】
1.一种低温尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一、设计合成嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶基因，并插入pET28表达载体，构建DNA连接酶的重组表达质粒；重组嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶N端带有来源于pET28载体的6个连续组氨酸亲和纯化标签，用于固定化镍离子亲和层析纯化；步骤二，重组表达嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶；将嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株；将表达菌株培养至OD600=0.6，加入0.5mM诱导剂IPTG，在20℃温度下培养12小时，诱导嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶表达；嗜冷细菌Colwelliapsychrerythraea尿嘧啶DNA糖苷酶重组蛋白的氨基酸序列（氮端→碳端）如SEQIDNO:1所示；SEQIDNO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘喜朋，
申请(专利权)人：苏州旷世骏弛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32