单向式羊膜脱细胞方法技术

本发明专利技术涉及一种单向式羊膜脱细胞方法，包括以下步骤：a)新鲜羊膜的剥离和清洗；b)将步骤a)所得羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上；c)将b)步骤处理的羊膜放入脱细胞溶液中处理；d)将c)步骤处理的羊膜洗涤后放入核酸酶溶液中处理；e)将d)步骤处理的羊膜洗涤后得到人脱细胞羊膜。与现有技术相比，本发明专利技术结合了羊膜结构特点，采用单向式脱细胞方法，将羊膜基质层保护起来，使羊膜平铺展开，上皮面充分接触脱细胞溶液，有利于彻底脱出羊膜上皮细胞，而基质层极少量的细胞则由于组织的渗透性只接触少量脱细胞溶液而被脱除。该脱细胞方法操作简单、方便，保证了工艺的稳定性，有利于大规模生产。

One way amniotic membrane decellular method

The present invention relates to a one-way amniotic cell decellular method, including the following steps: a) the stripping and cleaning of the fresh amniotic membrane; b) step a) the amniotic membrane is laid flat on the support body with a plane; c) the amniotic membrane treated by B) is disposed in the acellular solution; D) the amniotic membrane treated by the C step is washed into the nuclease solution. Intermediate treatment; E) washed human amniotic membrane after D procedure to obtain human acellular amniotic membrane. Compared with the existing technology, the invention combines the characteristics of amniotic membrane structure. The amniotic membrane matrix layer is protected by one way cell method, the amniotic membrane is protected, the amniotic membrane is spread out, the upper surface is fully exposed to the acellular solution, and it is beneficial to completely remove the amniotic epithelial cells, and the very small number of cells in the matrix are only connected by the permeability of the tissue. Remove a small amount of acellular solution and be removed. The acellular method is simple and convenient to operate, which ensures the stability of the process and is conducive to large-scale production.

【技术实现步骤摘要】
单向式羊膜脱细胞方法
本专利技术涉及组织工程
，尤其是涉及一种单向式羊膜脱细胞方法。
技术介绍
羊膜，即人胎盘粘膜，为胎膜的最内层，与绒毛膜相贴紧密，正常羊膜厚为0.02-0.5mm，光滑，半透明薄膜，具有一定的韧性，无血管、神经和淋巴管，由单层上皮细胞层、致密的基底膜以及无血管的基质等成份组成。羊膜基质中含有大量的胶原、纤粘连蛋白和层粘连蛋白等成份，由于其含有生长因子、极低的免疫原性、抗菌、减轻炎症、抗纤维化、抑制新生血管形成等特性，在医疗领域有100多年的应用历史，其主要用途有眼表疾病修复、鼓膜损伤修补、烧伤后表面覆盖等。目前临床上使用的羊膜主要为新鲜羊膜、深冷保存羊膜和脱细胞羊膜(也称羊膜脱细胞基质)。国外多采用深低温(-80℃)保存的含有上皮细胞的羊膜，国内已有在临床应用的干燥常温保存的含上皮细胞的羊膜，但技术工艺要求复杂，且由于羊膜上皮细胞的存在，在眼科，羊膜植片可能会发生植片排斥反应、植片脱落、移位溶解、感染等并发症，其安全性存在一定的风险。羊膜脱细胞基质不含羊膜上皮细胞，保留了羊膜基底膜与基质层，它的主要成分是Ⅲ、Ⅳ及Ⅴ型胶原蛋白，蛋白多糖和糖蛋白，是一种天然的细胞外基质，是良好的组织工程生物载体材料。但作为同种异体生物组织支架材料，应用于临床的主要问题在于要克服其内在细胞所带来的免疫原性。常用的羊膜脱细胞处理方法是采用表面活性剂或表面活性剂结合机械力刮除，胰酶酶解及物理方法。公开号为CN103114073B的中国专利公开了一种人羊膜的脱细胞方法，其采用表面活性剂TritonX-100结合胰脂酶和DNA酶，用浸泡震荡方式脱除羊膜中的细胞，但由于羊膜较薄，在溶液中极易卷曲(或扭曲)形成空泡，漂浮在溶液上表面而无法有效接触处理溶液，不能达到完全脱细胞效果，且对羊膜基质的力学和化学等性能有不同程度的损伤。公开号为CN1594555A的中国专利公开了羊膜3D基质组织工程支架羊膜平铺固定完全脱细胞方法及装置，其采用先用胰蛋白酶浸泡对羊膜脱细胞处理，再将浸泡后的羊膜平铺在固定装置上，通过旋转体使胰蛋白酶溶液旋动进而再次脱细胞。胰蛋白酶对细胞外基质有破坏作用且不易去除，制备过程中可能会产生二次污染，并且该专利技术采用先浸泡酶处理再平铺酶处理，过度酶解会破坏羊膜基质的蛋白结构及韧性。此外，该固定装置复杂，不利于大规模生产。公开号为CN107233623A的中国专利公开了一种可用于组织工程皮肤生物支架的脱细胞羊膜的制备方法。首先对羊膜进行漂洗消毒，然后浸泡于DMEM和甘油中-80℃保存6个月；然后将浸泡的羊膜从-80℃到37℃反复冻融2～4次，随后将DMEM和甘油洗去在trypsin-EDTA中过夜孵育；然后用含有血清的DMEM对孵育的羊膜进行终止消化，之后用PBS冲洗，冻干后获得脱细胞羊膜。将反复冻融的物理脱细胞方法和胰酶消化的化学脱细胞方法相结合，并调整各工艺步骤相适应，促使羊膜中的细胞被高效彻底地去除且避免机械性损伤，同时保留了羊膜中较多的细胞因子。但是该专利公开的方法周期太长，步骤繁琐。羊膜的主要细胞位于羊膜上皮层，而基底膜无细胞，基质层只有极少量细胞，而采用单纯的浸泡震荡处理，虽然去除了羊膜上皮面的细胞，但基质层也同样遭受脱细胞试剂的处理，这对基底膜和基质层的结构和成分产生明显损伤。脱细胞处理不只是简单选取脱细胞方法，更应该结合所用组织的结构特点进行无损基质的处理方式。怎样只去除羊膜上皮细胞和保护羊膜基底膜及基质层结构，现有技术中都没有给出解决方案。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种单向式羊膜脱细胞方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术第一方面，提供一种单向式羊膜脱细胞方法，包括以下步骤：a)新鲜羊膜的剥离和清洗；b)将步骤a)所得羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上；c)将b)步骤处理的羊膜放入脱细胞溶液中处理；d)将c)步骤处理的羊膜洗涤后放入核酸酶溶液中处理；e)将d)步骤处理的羊膜洗涤后得到人脱细胞羊膜，即人羊膜细胞外基质支架材料。在本专利技术的一个实施方式中，所述新鲜羊膜是健康的人胎盘粘膜。所述健康是指乙肝病毒、丙肝病毒、衣原体、人免疫缺陷病毒、梅毒检测均为阴性。在本专利技术的一个实施方式中，所述剥离是指将羊膜和绒毛膜与胎盘分离，再将绒毛膜剥离去除，并用无菌镊子去除残留凝胶状物质。将羊膜和绒毛膜与胎盘分离，再将绒毛膜剥离去除，并用无菌镊子去除残留凝胶状物质可以采用常规的生物学方法。在本专利技术的一个实施方式中，步骤a)所述清洗指用无菌的0.9％氯化钠注射液在4-37℃条件下对剥离后的羊膜进行清洗，直至羊膜无血丝、呈透明状。在本专利技术的一个实施方式中，步骤b)所述将步骤a)所得羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上的方法为：将羊膜平铺在支撑体的平面上，用弹性圈将平铺后羊膜的边缘固定在支撑体侧面的凹槽中。所述弹性圈指医用弹性圈，包括但不限于弹性医用橡皮圈、或医用橡皮筋、或医用乳胶管等。所述支撑体形状包括长方体、正方体、梯形体、圆柱体、圆台、椭球体等，所述支撑体优选为没有棱角的形状，若所述支撑体为含有棱角的形体，将棱角由直角变为弧形。所述支撑体材质为医用级塑料或医用级不锈钢。在本专利技术的一个实施方式中，将步骤a)所得羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上时，将羊膜毛面(即羊膜的基质层)向下平整铺在支撑体表面。在本专利技术的一个实施方式中，将b)步骤处理的羊膜放入脱细胞溶液中处理，可选用的实施方式包括：将b)步骤处理后平铺在支撑体上的羊膜放入含脱细胞溶液的带盖容器内处理，带盖容器为医用级塑料或医用级不锈钢。处理时需要连同支撑体一起放入脱细胞溶液中，支撑体的目的是保证羊膜呈平铺状态，且保证羊膜毛面(即羊膜的基质层)不直接与溶液接触，而溶液仅仅有少量通过羊膜上皮层渗透到羊膜的基质层。在本专利技术的一个实施方式中，所述脱细胞溶液包括主成分及配制溶液，所述主成分选择TrypLETMSelectEnzyme(一种胰蛋白酶替代物)、胰蛋白酶、中性蛋白酶、非离子型去污剂、两性离子去污剂中的一种或多种的组合；所述配制溶液为无菌的0.9％氯化钠注射液、磷酸盐缓冲液、D-Hanks溶液或HEPES溶液。所述非离子型去污剂选择TritonX-100、Tween-80等。所述两性离子去污剂选择3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、十二烷基二甲基羟丙基磺基甜菜碱等。本专利技术中，脱细胞剂主成分包括TrypLETMSelectEnzyme(一种胰蛋白酶替代物)、胰蛋白酶、中性蛋白酶、非离子型去污剂、两性离子去污剂等，这些成分都能去除细胞，其脱除细胞原理都是通过破坏细胞膜结构而脱除细胞(酶类的作用是水解膜蛋白，破坏细胞膜与组织基质之间连接而去除细胞，去污剂类的作用是破坏细胞膜上蛋白质-蛋白质、蛋白质-脂质、脂质-脂质之间的连接，将细胞膜蛋白、脂质等包裹起来形成胶团而去除细胞)。在本专利技术的一个实施方式中，将b)步骤处理的羊膜放入脱细胞溶液中处理的条件为：在4-37℃下震荡处理1min-48h。脱细胞处理时震荡的目的是保证溶液的充分混匀和溶液与组织的充分接触。在本专利技术的一个实施方式中，将c)步骤处理的羊膜洗涤后放入核酸酶溶液中处理，可选用的实施方式包括：将在脱细胞溶液处理后，仍然平铺在支撑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单向式羊膜脱细胞方法，其特征在于，包括以下步骤：a)新鲜羊膜的剥离和清洗；b)将步骤a)所得羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上；c)将b)步骤处理的羊膜放入脱细胞溶液中处理；d)将c)步骤处理的羊膜洗涤后放入核酸酶溶液中处理；e)将d)步骤处理的羊膜洗涤后得到人脱细胞羊膜。

【技术特征摘要】
1.一种单向式羊膜脱细胞方法，其特征在于，包括以下步骤：a)新鲜羊膜的剥离和清洗；b)将步骤a)所得羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上；c)将b)步骤处理的羊膜放入脱细胞溶液中处理；d)将c)步骤处理的羊膜洗涤后放入核酸酶溶液中处理；e)将d)步骤处理的羊膜洗涤后得到人脱细胞羊膜。2.根据权利要求1所述的一种单向式羊膜脱细胞方法，其特征在于，将步骤a)所得羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上时，将羊膜的基质层向下平整铺在支撑体表面。3.根据权利要求1所述的一种单向式羊膜脱细胞方法，其特征在于，步骤c)、d)、e)对羊膜处理时，所述羊膜均固定在具有平面的支撑体上。4.根据权利要求1所述的一种单向式羊膜脱细胞方法，其特征在于，所述支撑体保障羊膜的基质层不直接与脱细胞溶液或核酸酶溶液接触，脱细胞溶液或核酸酶溶液仅通过羊膜上皮层渗透到羊膜的基质层。5.根据权利要求1所述的一种单向式羊膜脱细胞方法，其特征在于，所述支撑体包括一作为支撑面的平面，以及位于支撑面侧面的凹槽，所述支撑体为刚性物体，将步骤a)所得羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上的方法为：将羊膜平铺在支撑体的平面上，用弹性圈将平铺后羊膜的边缘固定在支撑体侧面的凹槽中。6.根据权利要求1所述的一种单向式羊膜脱细胞方法，其特征在于，所述支撑体采用医用级软性材料，将步骤a)所得羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上...

【专利技术属性】
技术研发人员：董教明，吴复跃，何振东，
申请(专利权)人：上海睿泰生物科技股份有限公司，合肥欣睿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31