一种高产胞外多糖菌株及其多糖分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种高产胞外多糖菌株及其多糖分离纯化方法。该菌株命名为柠檬明串珠菌(Leuconstoc citreum)B‑2，于2017年12月04日保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.15014。本发明专利技术从菠萝自然发酵液中分离筛选出一株高产胞外多糖的乳酸菌，经鉴定为柠檬明串珠菌(Leuconstoc citreum)。将柠檬明串珠菌(Leuconstoc citreum)B‑2接种于产糖发酵培养基中培养得到发酵液，离心去除菌体，用乙醇沉淀，获得粗多糖；将粗多糖进行纯化，即得胞外多糖。经结构性质测定，该多糖为葡聚糖，呈高度分支结构。这种纯化方法纯度好、产糖量高、操作简便。本发明专利技术用于产胞外多糖。本发明专利技术技术方案拓展了产胞外多糖的微生物菌种来源，并提供了一种乳酸菌产胞外多糖纯化的新方法。

A high yield exo polysaccharide strain and its polysaccharide separation and purification method

The invention discloses a high-yield exo polysaccharide strain and a method for separating and purifying polysaccharide. The strain was named Leuconstoc citreum B 2, and was preserved on 04 December 2017 to the management center of the Chinese common microbial species preservation, and the preservation was numbered as CGMCC No.15014. A lactic acid bacteria isolated from pineapple natural fermentation broth and produced high yield exo polysaccharide is identified as Leuconstoc citreum. Leuconstoc B citreum 2 was inoculated in the fermentation medium of sugar production to get the fermentation broth, centrifugally removed the bacteria and precipitated with ethanol to obtain the polysaccharide, and the crude polysaccharide was purified, that is, the extracellular polysaccharide was obtained. The polysaccharide is dextran with high branching structure. The purification method is characterized by high purity, high sugar yield and simple operation. The invention is used for the production of extracellular polysaccharide. The technical proposal of the invention expands the source of microbial polysaccharides producing extracellular polysaccharides, and provides a new method for purifying extracellular polysaccharide produced by lactic acid bacteria.

【技术实现步骤摘要】
一种高产胞外多糖菌株及其多糖分离纯化方法
本专利技术涉及一种高产胞外多糖菌株及其多糖分离纯化方法。
技术介绍
胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是微生物(如细菌、酵母、真菌)在生长过程中分泌到细胞外的粘液或荚膜多糖。在众多产胞外多糖的微生物中，乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB)具有发酵周期短、营养要求简单等优越性，成为微生物胞外多糖的理想来源。乳酸菌胞外多糖已作为稳定剂、增稠剂被用于酸奶、奶酪等发酵奶制品的生产中。此外，乳酸菌胞外多糖还有降低胆固醇、抗氧化、抗肿瘤、对消化道的调节等作用。与其他多糖相比，乳酸菌胞外多糖的研究更具有实际价值，乳酸菌生长极为迅速，它的胞外多糖提取工艺更简单，安全性较高、价格便宜，比其他微生物多糖更适用于人类。因此，挖掘自然界中丰富的乳酸菌资源，发现高产胞外多糖的乳酸菌细菌菌株，以短周期、低成本获得更多的胞外多糖，一直是微生物学领域的研究热点。此前，有研究者为得到纯的胞外多糖，采用固体培养基，直接从培养基表面提取胞外多糖，此法对操作者要求高，且培养基不能被充分利用，产糖量很低，造成成本浪费。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了拓展产胞外多糖的微生物菌种来源，提供一种乳酸菌胞外多糖的分离纯化新方法。所述胞外多糖菌株为柠檬明串珠菌(Leuconstoccitreum)B-2，已于2017年12月04日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京市朝阳区北辰路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.15014。该菌株经16SrRNA基因测序的结果见序列表SEQIDNO:1。所述高产胞外多糖菌株为革兰氏阳性细菌，不产芽孢和鞭毛，兼性厌氧，能以多种糖类为碳源进行乳酸发酵。菌落为圆形，不透明，灰白色，边缘整齐，略突起，正反面颜色一致，中央与边缘颜色一致。发酵葡萄糖产酸产气，接触酶阴性，不水解精氨酸，不产吲哚。微生物生理生化试验说明具有明串株菌属(Leuconostoc)的特性。本专利技术胞外多糖分离纯化方法，按以下步骤进行：1)将柠檬明串珠菌(Leuconstoccitreum)B-2接种于产糖发酵培养基中培养得到发酵液。将发酵液进行低温高速离心，去除菌体，取上清。2)将离心去除菌体后的上清用乙醇沉淀，静置，离心，取沉淀。3)将沉淀溶解于蒸馏水中，在溶液中加入三氯乙酸溶液以沉淀蛋白质，连续搅拌，离心，取上清液。4)将上清液用乙醇沉淀，静置，离心，取沉淀。5)将沉淀再溶解于蒸馏水中，进行透析，得到粗多糖溶液。6)将粗多糖进行凝胶柱层析，得到纯胞外多糖。在步骤1)中，所述离心温度为4℃，离心时间为30～40min，离心转速为4000rpm。在步骤2)所述乙醇浓度为95％，预冷温度为-20℃，乙醇:发酵液＝3:1，静置时间为12～24h，离心温度为4℃，离心时间为50～60min，离心转速为12000rpm。在步骤3)中所述加入80％三氯乙酸溶液至终浓度浓度为5％，连续搅拌3～4h，离心温度为4℃，离心时间为50～60min，离心转速为12000rpm。在步骤4)中所述乙醇浓度为95％，预冷温度为-20℃，乙醇:上清液＝3:1，静置12h，离心温度为4℃，离心时间为50～60min，离心转速为12000rpm。在步骤5)中所述于4℃冰箱透析48h，每8h换水一次。在步骤6)中所述纯化采用G-100凝胶过滤层析对多糖进行纯化，采用真空冷冻干燥法得到多糖产量为28.32±1.87g/L。本专利技术的有益效果为：本专利技术通过系列生物化学技术获得菌株发酵产物胞外多糖，采用现代提取技术对发酵液提取纯化获得高纯度多糖。经过系列实验验证，说明所获的菌株具有明串珠菌属的特性，在底物蔗糖的诱导下，产生大量胞外多糖。因此，柠檬明串珠菌(Leuconstoccitreum)B-2在产糖发酵培养基中发酵而得的发酵液中，含有胞外多糖，具有产糖周期短、产糖量高的优点。经结构性质测定，该多糖为葡聚糖，呈高度分支结构，直链部分含75％α-(1→6)糖苷键，支链部分含19％α-(1→3)糖苷键和少许α-(1→2)糖苷键。本专利技术技术采用液体培养基，既能充分利用培养基且产糖量可观，配合其他技术也保证了多糖的纯度。附图说明图1是柠檬明串珠菌(Leuconstoccitreum)B-2产黏菌落形态；图2是柠檬明串珠菌(Leuconstoccitreum)B-2胞外多糖凝胶过滤层析图谱；图3是柠檬明串珠菌(Leuconstoccitreum)B-2纯胞外多糖紫外光谱图；图4是柠檬明串珠菌(Leuconstoccitreum)B-2纯胞外多糖气相色谱图；图5是柠檬明串珠菌(Leuconstoccitreum)B-2纯胞外多糖傅里叶红外色谱图；图6是柠檬明串珠菌(Leuconstoccitreum)B-2纯胞外多糖一维核磁共振波谱图，图(a)、图(b)分别为一维氢谱图和一维碳谱图。具体实施方式实施例1：一种高产胞外多糖菌株的分离筛选1)培养基MRS基础培养基：葡萄糖20g，胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸铵2g，K2HPO42g，CH3COONa5g，MgSO4·7H2O0.58g，MnSO4·H2O0.25g，吐温801mL，蒸馏水1000mL，pH值6.5，115℃灭菌20min。MRS产糖发酵培养基：蔗糖75g，胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，K2HPO42g，CH3COONa5g，柠檬酸铵2g，MgSO4·7H2O0.58g，MnSO4·H2O0.25g，吐温801mL，蒸馏水1000mL，pH值6.5，115℃灭菌20min。2)样品预处理取菠萝发酵液1mL加入装有9mL的无菌生理盐水中，制成10-1浓度的样品液，震荡混匀后逐级稀释到适宜浓度，静置备用。3)产粘菌落初筛取上述各稀释度的菌液50μL涂布于产糖培养基琼脂平板中，于30℃恒温培养箱中培养24-48h。挑取平板上产粘的菌落区域，于产糖培养基琼脂平板上反复三区划线，得到纯培养物的平板置于4℃冰箱保存。4)菌株复筛将从平板上得到的纯培养物接种到MRS液体培养基中培养18h，再按2％(v/v)的接种量接种到产糖液体培养基中，于30℃培养48h。取发酵液于90℃水浴中加热10min，除去菌液中可能降解多糖的酶，冷却到室温。向发酵液中加入80％三氯乙酸溶液至终浓度为5％(m/v)，室温下搅拌2h，12000rpm4℃离心40min，去除细胞和蛋白沉淀。上清液装入透析袋中(截留分子量14000Da)，4℃冰箱中超纯水透析2d，每8h换一次水。定容后，采用苯酚硫酸法测定菌株产胞外多糖的产量。结合产粘菌落的粘液浓度，选取多糖产量较高的菌株。实施例2：一种高产胞外多糖菌株的鉴定经典的微生物生化检验说明，所获得的高产胞外多糖菌株具有明串珠菌属(Leuconostoc)的特性，革兰氏阳性细菌，不产芽孢和鞭毛，兼性厌氧。菌落为圆形，不透明，灰白色，边缘整齐，略突起，正反面颜色一致，中央与边缘颜色一致。本菌株不发酵半乳糖、乳糖、麦芽糖和棉籽糖。能够利用葡萄糖产酸产气，接触酶阴性，不水解精氨酸，不产吲哚。精氨酸产氨试验、H2S试验，淀粉水解试验，明胶液化试验均为阴性。根据其生理生化特性及16SrRNA序列分析的结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产胞外多糖菌株，其为柠檬明串珠菌(Leuconstoc citreum)B‑2，于2017年12月04日保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.15014。

【技术特征摘要】
1.一种高产胞外多糖菌株，其为柠檬明串珠菌(Leuconstoccitreum)B-2，于2017年12月04日保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.15014。2.一种高产胞外多糖菌株胞外多糖的分离纯化方法，其特征在于，采取如权利要求1所述的胞外多糖菌株，包括以下步骤：(1)将柠檬明串珠菌(Leuconstoccitreum)B-2接种于产糖发酵培养基中培养得到发酵液，将发酵液进行低温高速离心，去除菌体，取上清；(2)将离心去除菌体后的上清用乙醇沉淀，静置，离心，取沉淀；(3)将沉淀溶解于蒸馏水中，在溶液中加入三氯乙酸溶液以沉淀蛋白质，连续搅拌，离心，取上清液；(4)将上清液用乙醇沉淀，静置，离心，取沉淀；(5)将沉淀再溶解于蒸馏水中，进行透析，得到粗多糖溶液；(6)将粗多糖进行凝胶柱层析，得到纯胞外多糖。3.根据权利要求2所述的一种高产胞外多糖菌株的多糖分离纯化方法，其特征在于步骤(1)所述离心温度为4℃，离心时间为30～40min，离心转速为4000rpm。4.根据权利要求2所述的一种高产胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：周志江，冯芳，韩烨，肖华志，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12