HPLC检测马鞭草中齐墩果酸和熊果酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种HPLC检测马鞭草中齐墩果酸和熊果酸的方法，包括以下步骤：(1)制备对照品溶液：取齐墩果酸和熊果酸的对照品分别用甲醇制成对照品溶液；(2)制备待测样品溶液：取马鞭草药材经快速溶剂萃取，获得的萃取液用甲醇稀释，得到待测样品溶液；(3)制定标准曲线：取不同浓度的齐墩果酸和熊果酸的对照品溶液混合后上高效液相色谱仪进行定量测定，分别获得齐墩果酸和熊果酸的标准曲线；(4)测定待测样品溶液：取待测样品溶液上高效液相色谱仪进行定量测定，获得齐墩果酸和熊果酸的峰面积，然后根据齐墩果酸和熊果酸的标准曲线获得待测样品中齐墩果酸和熊果酸的含量。本发明专利技术提取效率高，检测简便快速。

【技术实现步骤摘要】
HPLC检测马鞭草中齐墩果酸和熊果酸的方法
本专利技术涉及检测马鞭草中齐墩果酸和熊果酸方法，尤其涉及一种HPLC检测马鞭草中齐墩果酸和熊果酸的方法。
技术介绍
齐墩果酸(oleanolicacid)和熊果酸(ursolicacid)都是五环三萜类化合物，是多种中药材均含有的活性成分，具有保肝、消炎、抗肿瘤、调血脂、免疫双向调解等药理作用。其检测的方法有分光光度法、薄层扫描和高效液相色谱法，齐墩果酸和熊果酸互为同分异构体，仅29、30位的甲基位置不同，分离存在一定困难，要将两者分开，色谱条件的选择非常重要，近年来采用HPLC测定的方法大多流动相组成复杂，出峰时间长，峰形和分离度不太理想。快速溶剂萃取(ASE)是指在密闭容器内于高温(50～200℃)和高压(3448～20685kPa)条件下，在短时间内，用有机溶剂提取固体或半固体样品的一种新型样品前处理方法。与超声、微波、回流、超临界萃取等成熟方法相比，ASE有萃取溶剂用量少、提取时间短、萃取效率高、操作简单方便、安全和自动化程度高等优点。国外已有学者将这项技术应用于植物药定量和定性分析中样品的前处理，但在中药材有效成分的定量和定性分析中作为样品的前处理方法应用较少。马鞭草又叫马鞭梢、铁马鞭、白马鞭、疟马鞭、凤颈草、紫顶龙芽草、野荆芥。全草含马鞭草苷、鞣质、挥发油，根和茎种含水苏糖，叶种含腺苷和B—胡萝卜素。药性：味苦，性寒，归肝、脾经。全草含马鞭草甙(verbenalin)，ey5-羟基马鞭草甙；另含苦杏仁酶、鞣质；戟叶马鞭草甙(hastatoside)，羽扇豆醇(lupelo)，β-谷甾醇(β-sitosterol)，熊果酸(ursolicacid)，齐墩果酸(oleanolicacid)，桃叶珊瑚甙(aucubin)，蒿黄素(artemetin)。叶中含马鞭草新甙(verbascoside)，腺甙(adenosine)，β-胡萝卜素(β-carotenne)。根和茎中含水苏糖(stachyose)。《中国药典》2015年版记载了马鞭草的成分测定方法，但是其提取时间长，为300min，药典方法使用C18色谱柱，分析时间为35～65min，使用缓冲盐或三乙胺，试剂配制过程繁琐。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提供一种HPLC检测马鞭草中齐墩果酸和熊果酸的方法。本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：一种HPLC检测马鞭草中齐墩果酸和熊果酸的方法，包括以下步骤：(1)制备对照品溶液：取齐墩果酸和熊果酸的对照品分别用甲醇制成对照品溶液；(2)制备待测样品溶液：取马鞭草药材经快速溶剂萃取，获得的萃取液用甲醇稀释，得到待测样品溶液；(3)制定标准曲线：取不同浓度的齐墩果酸和熊果酸的对照品溶液混合后上高效液相色谱仪进行定量测定，分别获得齐墩果酸和熊果酸的标准曲线；(4)测定待测样品溶液：取待测样品溶液上高效液相色谱仪进行定量测定，获得齐墩果酸和熊果酸的峰面积，然后根据齐墩果酸和熊果酸的标准曲线获得待测样品中齐墩果酸和熊果酸的含量。所述步骤(3)和(4)中的色谱条件：150mm×2.1mm，3μmThermoAcclaimC30色谱柱，进样量1μ量，以体积比为90∶10的乙腈-0.2％醋酸溶液为流动相，检测波长为205nm，柱温18℃，体积流量0.2mL/min。所述步骤(1)中，分别精密称取齐墩果酸对照品54.2mg至50mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成质量浓度为1.084mg/mL对照品溶液；精密称取熊果酸对照品81.6mg至100mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成质量浓度为0.8160mg/mL对照品溶液。所述步骤(2)中，取马鞭草药材待测样品研成粉末，精密称取样品粉末0.5g，与1g硅藻土混合均匀后，置预先铺上纤维滤膜的5mL萃取池中，加入硅藻土以填满萃取池为宜，拧紧萃取池上盖，进行快速溶剂萃取，萃取溶剂为甲醇、萃取温度100℃、静态萃取时间6min、冲洗体积100％、静态萃取1次、吹扫时间为100s，萃取结束后，把萃取液转移至25mL量瓶中，用甲醇清洗萃取瓶3次并合并至容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得待测样品溶液。所述步骤(4)中，不同浓度的齐墩果酸和熊果酸的对照品溶液按体积比为1:1进行混合。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1.本专利技术采用快速溶剂萃取法提取马鞭草药材，时间仅需10min，提取效率大为提高。2.本专利技术使用150mm×2.1mm，3μmThermoAcclaimC30色谱柱分析时间仅为88min，分析效率提高了至少4倍。3.流动相使用0.2％醋酸作为流动相配制过程更简便。具体实施方式实施例1(1)制备对照品溶液：分别精密称取齐墩果酸对照品54.2mg至50mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成质量浓度为1.084mg/mL对照品溶液；精密称取熊果酸对照品81.6mg至100mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成质量浓度为0.8160mg/mL对照品溶液。(2)制备待测样品溶液：取马鞭草药材待测样品研成粉末，精密称取样品粉末0.5g，与1g硅藻土混合均匀后，置预先铺上纤维滤膜的5mL萃取池中，加入硅藻土以填满萃取池为宜，拧紧萃取池上盖，进行快速溶剂萃取，萃取溶剂为甲醇、萃取温度100℃、静态萃取时间6min、冲洗体积100％、静态萃取1次、吹扫时间为100s，萃取结束后，把萃取液转移至25mL量瓶中，用甲醇清洗萃取瓶3次并合并至容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得待测样品溶液。(3)制定标准曲线：分别精密吸取上述2个对照品储备液各0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2mL，置6个10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得一系列混合对照品溶液，上高效液相色谱仪进行定量测定。以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得回归方程及相关系数，齐墩果酸Y＝4785.9528X+98.7319，R2＝0.9999。熊果酸Y＝7906.0774X+1.2709，R2＝0.9997，齐墩果酸在9.84～131.08μg/mL、熊果酸在7.655～92.85μg/mL内呈良好的线性关系。色谱条件：150mm×2.1mm，3μmThermoAcclaimC30色谱柱，进样量1μ量，以体积比为90∶10的乙腈-0.2％醋酸溶液为流动相，检测波长为205nm，柱温18℃，体积流量0.2mL/min。(4)测定待测样品溶液：取待测样品溶液上高效液相色谱仪进行定量测定，色谱条件与步骤(4)相同，获得齐墩果酸和熊果酸的峰面积，然后根据齐墩果酸和熊果酸的标准曲线获得待测样品中齐墩果酸和熊果酸的含量。(5)精密度：取混合对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果峰面积RSD分别为1.5％、1.7％，表明仪器精密度良好。(6)稳定性试验：取马鞭草供试品溶液，室温下放置，分别于0、1、3、6、12h测定，记录峰面积。结果马鞭草中齐墩果酸峰面积的RSD为2.2％，熊果酸峰面积的RSD为2.5％。(7)重复性试验：取马鞭草供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，测得马鞭草中齐墩果酸质量分数的RSD为2.2％，熊果酸质量分数的RSD为1.6％。(8)加样回收试验：取马鞭草供试品溶液按上述色谱条件进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种HPLC检测马鞭草中齐墩果酸和熊果酸的方法，其特征是，包括以下步骤：(1)制备对照品溶液：取齐墩果酸和熊果酸的对照品分别用甲醇制成对照品溶液；(2)制备待测样品溶液：取马鞭草药材经快速溶剂萃取，获得的萃取液用甲醇稀释，得到待测样品溶液；(3)制定标准曲线：取不同浓度的齐墩果酸和熊果酸的对照品溶液混合后上高效液相色谱仪进行定量测定，分别获得齐墩果酸和熊果酸的标准曲线；(4)测定待测样品溶液：取待测样品溶液上高效液相色谱仪进行定量测定，获得齐墩果酸和熊果酸的峰面积，然后根据齐墩果酸和熊果酸的标准曲线获得待测样品中齐墩果酸和熊果酸的含量。

【技术特征摘要】
1.一种HPLC检测马鞭草中齐墩果酸和熊果酸的方法，其特征是，包括以下步骤：(1)制备对照品溶液：取齐墩果酸和熊果酸的对照品分别用甲醇制成对照品溶液；(2)制备待测样品溶液：取马鞭草药材经快速溶剂萃取，获得的萃取液用甲醇稀释，得到待测样品溶液；(3)制定标准曲线：取不同浓度的齐墩果酸和熊果酸的对照品溶液混合后上高效液相色谱仪进行定量测定，分别获得齐墩果酸和熊果酸的标准曲线；(4)测定待测样品溶液：取待测样品溶液上高效液相色谱仪进行定量测定，获得齐墩果酸和熊果酸的峰面积，然后根据齐墩果酸和熊果酸的标准曲线获得待测样品中齐墩果酸和熊果酸的含量。2.根据权利要求1所述的HPLC检测马鞭草中齐墩果酸和熊果酸的方法，其特征是，所述步骤(3)和(4)中的色谱条件：150mm×2.1mm，3μmThermoAcclaimC30色谱柱，进样量1μ量，以体积比为90∶10的乙腈-0.2％醋酸溶液为流动相，检测波长为205nm，柱温18℃，体积流量0.2mL/min。3.根据权利要求1所述的HPLC检测马鞭草中齐墩果酸和熊果酸的方法，其特征是，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张云平，陈启钊，梁剑锋，
申请(专利权)人：广西壮族自治区梧州食品药品检验所，
类型：发明
国别省市：广西,45