测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法，包括以下步骤：制备待测样品溶液；制备标准溶液；将标准系列工作溶液注入液质联用仪，确定4种硝基呋喃类药物代谢产物的出峰位置及其定性定量离子对，以定量离子对丰度为纵坐标，以浓度为横坐标，制作标准曲线方程；将待测样品溶液作相应检测所得的数据代入标准曲线方程计算，得到待测样品中各硝基呋喃类药物代谢产物的含量。4种硝基呋喃类药物代谢产物为：呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃它酮代谢物(AOMZ)、呋喃西林代谢物(SEM)、呋喃妥因代谢物(AHD)。

【技术实现步骤摘要】
测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法
本专利技术涉及一种适用于动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的分散固相萃取结合通过式固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱检测法。
技术介绍
硝基呋喃类药物，是一类人工合成的抗生素，具有5-硝基呋喃母核机构，主要包括呋喃唑酮(FZD)、呋喃妥因(NFT)、呋喃西林(NFZ)、呋喃它酮(FTD)等。硝基呋喃类药物对细菌具有广谱的抑制和杀灭作用，对大量革兰氏阳性和阴性细菌、真菌、原虫均有作用；硝基呋喃类药物具有慢性毒性，可引起消化道反应，如恶心、呕吐、厌食、腹泻等，还可引起溶血性贫血和黄疸；长时间或大剂量使用硝基呋喃类药物均能对动物体产生毒性作用，还具有致癌、致畸、致突变作用。2008年，美国环境保护署环境健康风险评估办公室将呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮列入加利福利亚州65种致癌物名单(StateofCaliforniaProposition65CarcinogensList)。硝基呋喃类药物的代谢途径大多相似，通常会在酶的作用下使呋喃开环形成丙烯腈衍生物，此衍生物再同谷胱甘肽(glutathione，GSH)、巯基乙醇、膜蛋白等进行可逆结合，在低pH环境下结合比较牢固。该结合物分别具有呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃它酮代谢物(AOMZ)、呋喃西林代谢物(SEM)、呋喃妥因代谢物(AHD)等的完整侧链结构，在弱酸性环境下释放这些侧链结构，经过冷藏、(烘烤、油炸、微波)烹煮等处理后，这些小分子代谢物依然能维持稳定。硝基呋喃类药物，由于价格低廉和良好的抗菌效果，被广泛应用与禽畜、水产养殖。虽然各国都对硝基呋喃类药物在食用动物的使用作了严格的限定，但是该类药物的滥用仍然屡禁不止。动物胶类中药是以动物的皮、角、甲或骨为原料，将其中的胶质煎至水中，以豆油、黄酒等为辅料，浓缩，干燥后制成的固体胶。胶体中药含有较高含量的蛋白质，当动物原体喂以硝基呋喃类药物时，硝基呋喃类药物在动物体内的半衰期短，代谢速度快，其代谢产物能够与组织蛋白质紧密结合，以结合态形式在体内残留较长时间，甚至经过蒸煮、烘烤、磨碎和微波加热也无法有效降解，且毒性更强，所以胶体中药类中的硝基呋喃类药物残留问题尤其需要引起人们的注意。目前，国内尚无相关动物胶类中药中硝基呋喃类药物代谢产物残留的超高效液相色谱-串联质谱检测方法的相关报道。近年来，我国医疗模式正由“疾病治疗”转变为“疾病预防”，“治未病”的意识越来越为大众所接受。因此，作为人们常用为滋补药的胶类中药，也随之逐渐火热，胶类中药生产企业如雨后春笋般出现。目前，仅山东省内的胶类中药生产企业就达上百家。其中，胶类中药整个行业产品及胶类复方制剂有400余种，阿胶行业发展呈现出一派“蓬勃”景象。中药胶剂是祖国传统医药宝库中重要的组成部分，使用历史悠久，原料种类来源丰富、生产工艺繁复、临床应用广泛，且外观性状、组织特征和化学组成等与其他动物源食品相比，存在很大差异，对动物胶类中药的硝基呋喃类药物代谢产物残留检测问题就显得非常棘手。本专利技术很好的解决了在检测动物胶类中药中硝基呋喃类药物代谢产物残留过程中的问题，为保障人类健康、提升企业自身技术发展水平、促进我国检测技术的发展，提升我国胶类中药质量安全检测技术在国际上的地位，增加就业，带动胶类中药产业的全面进步，为技术的进步、产业的转型升级都具有很大的经济社会效益，研究动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的分散固相萃取结合通过式固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱检测法具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种简便、定性定量，灵敏度高的测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法，即提供一种适用于动物源胶类中药中四种硝基呋喃类代谢产物药物残留检测的分散固相萃取结合通过式固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法，包括以下步骤：1)、制备待测样品溶液：1.1、将待测样品粉粹机粉碎后混匀，得试样；1.2、称取试样1～5g(较佳为2g，精确至0.01g)，置于具塞离心管内，加入5～50ml(较佳为10ml)0.1～0.5mol/L(较佳为0.2mol/L)盐酸溶液，溶解(超声溶解)；1.3、在步骤1.2所得的溶解后试样溶液中加入50～200ul(较佳为100ul)0.1～1mg/ml(较佳为0.5mg/ml)胃蛋白酶，同时加入50～200ul(较佳为100ul)2-硝基苯甲醛溶液(乙醇溶解)，37℃恒温水浴振荡6～24h(较佳为12h)；1.4、在步骤1.3所得的样品溶液中精密加入5～20ml(较佳为10mL)含1～10％(v/v)(较佳为5％)甲酸的乙腈溶液，漩涡振荡提取5～20min(较佳为10min)，加入2～10g(较佳为5g)氯化钠和5～10g(较佳为8g)无水硫酸钠，旋涡1～5min(较佳为2min)，以4000～8000r/min(较佳为5000r/min)的速度离心2～10min(较佳为5min)，精密吸取上清液Ⅰ(5ml)全部转移至10mL聚丙烯离心管中，待净化；1.5、在步骤1.4所得的待净化样液中加入净化剂(内含500～2000mg(较佳为1000mg)无水硫酸钠，100～500mg(较佳为300mg)C18-N以及100～500mg(较佳为250mg)NH2-PSA)，旋涡1～5min(较佳为2min)混匀，以4000～8000r/min(较佳为5000r/min)的速度离心2～10min(较佳为5min)；1.6、精密取步骤1.5所得的上清液Ⅱ1～5ml(较佳为3ml)置于PRiMEHLB固相萃取柱(3ml，60mg)中，取滤液用0.20～0.45um过滤头过滤，得上清液Ⅲ；目的是供超高效液相色谱-串联质谱仪进行定性定量分析；2)、制备标准溶液2.1、用色谱纯有机溶剂(甲醇或乙腈)分别将4种硝基呋喃类药物代谢产物标准物质(如表1所示)溶解，配置成浓度均为1000ug/mL的4种硝基呋喃类药物代谢产物标准储备溶液，于-20℃保存；2.2、各取适量上述标准储备溶液用有机溶剂(甲醇或乙腈)配制成浓度为100mg/L的混合标准储备溶液；2.3、分别取事先已知为阴性的粉碎后的空白样品(与实际检测样品的基质一样)6份，每份取2g，分别加入适量的混合标准储备溶液，按照1)待测溶液制备基质标准溶液，使得最终6份样品溶液中四种硝基呋喃类药物代谢产物浓度分别浓度为2ug/L、5ug/L、10ug/L、20ug/L、50ug/L、100ug/L，作为标准系列工作溶液；3)、将标准系列工作溶液注入液质联用仪，确定4种硝基呋喃类药物代谢产物的出峰位置及其定性定量离子对，以定量离子对丰度为纵坐标，以浓度为横坐标，制作标准曲线方程；4)、取步骤1)所得的上清液Ⅲ按步骤3)方法测定上清液中各硝基呋喃类药物、峰面积及其定量定性离子对，根据各出峰时间以及定性定量离子对丰度比进行定性分析，按照步骤3)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中各硝基呋喃类药物代谢产物的含量。作文本专利技术的改进：所述4种硝基呋喃类药物代谢产物残留：呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃它酮代本文档来自技高网...

【技术保护点】
测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法，其特征是包括以下步骤：1)、制备待测样品溶液：1.1、将待测样品粉粹机粉碎后混匀，得试样；1.2、称取试样1～5g，加入5～50ml的0.1～0.5mol/L盐酸溶液，溶解；1.3、在步骤1.2所得的溶解后试样溶液中加入50～200ul的0.1～1mg/ml胃蛋白酶，同时加入50～200ul的2‑硝基苯甲醛溶液，37±1℃恒温水浴振荡6～24h；所述2‑硝基苯甲醛溶液的浓度为0.1mol/L；1.4、在步骤1.3所得的样品溶液中精密加入5～20ml含1～10％(v/v)甲酸的乙腈溶液，漩涡振荡提取5～20min，加入2～10g氯化钠和5～10g无水硫酸钠，旋涡1～5min，以4000～8000r/min的速度离心2～10min，吸取上清液Ⅰ5ml待净化；1.5、在步骤1.4所得的待净化样液中加入净化剂，旋涡1～5min混匀，以4000～8000r/min的速度离心2～10min；1.6、取步骤1.5所得的上清液Ⅱ1～5ml置于PRiME HLB固相萃取柱中，取滤液用0.20～0.45um过滤头过滤，得上清液Ⅲ；2)、制备标准溶液2.1、用有机溶剂分别将4种硝基呋喃类药物代谢产物标准物质溶解，配置成浓度均为1000ug/mL的4种硝基呋喃类药物代谢产物标准储备溶液；2.2、各取上述标准储备溶液用有机溶剂配制成浓度为100mg/L的混合标准储备溶液；2.3、分别取事先已知为阴性的粉碎后的空白样品，加入混合标准储备溶液后，按照步骤1)所述方法制备基质标准溶液，作为标准系列工作溶液；3)、将标准系列工作溶液注入液质联用仪，确定4种硝基呋喃类药物代谢产物的出峰位置及其定性定量离子对，以定量离子对丰度为纵坐标，以浓度为横坐标，制作标准曲线方程；4)、取步骤1)所得的上清液Ⅲ按步骤3)方法测定上清液中各硝基呋喃类药物、峰面积及其定量定性离子对，根据各出峰时间以及定性定量离子对丰度比进行定性分析，按照步骤3)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中各硝基呋喃类药物代谢产物的含量。...

【技术特征摘要】
1.测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法，其特征是包括以下步骤：1)、制备待测样品溶液：1.1、将待测样品粉粹机粉碎后混匀，得试样；1.2、称取试样1～5g，加入5～50ml的0.1～0.5mol/L盐酸溶液，溶解；1.3、在步骤1.2所得的溶解后试样溶液中加入50～200ul的0.1～1mg/ml胃蛋白酶，同时加入50～200ul的2-硝基苯甲醛溶液，37±1℃恒温水浴振荡6～24h；所述2-硝基苯甲醛溶液的浓度为0.1mol/L；1.4、在步骤1.3所得的样品溶液中精密加入5～20ml含1～10％(v/v)甲酸的乙腈溶液，漩涡振荡提取5～20min，加入2～10g氯化钠和5～10g无水硫酸钠，旋涡1～5min，以4000～8000r/min的速度离心2～10min，吸取上清液Ⅰ5ml待净化；1.5、在步骤1.4所得的待净化样液中加入净化剂，旋涡1～5min混匀，以4000～8000r/min的速度离心2～10min；1.6、取步骤1.5所得的上清液Ⅱ1～5ml置于PRiMEHLB固相萃取柱中，取滤液用0.20～0.45um过滤头过滤，得上清液Ⅲ；2)、制备标准溶液2.1、用有机溶剂分别将4种硝基呋喃类药物代谢产物标准物质溶解，配置成浓度均为1000ug/mL的4种硝基呋喃类药物代谢产物标准储备溶液；2.2、各取上述标准储备溶液用有机溶剂配制成浓度为100mg/L的混合标准储备溶液；2.3、分别取事先已知为阴性的粉碎后的空白样品，加入混合标准储备溶液后，按照步骤1)所述方法制备基质标准溶液，作为标准系列工作溶液；3)、将标准系列工作溶液注入液质联用仪，确定4种硝基呋喃类药物代谢产物的出峰位置及其定性定量离子对，以定量离子对丰度为纵坐标，以浓度为横坐标，制作标准曲线方程；4)、取步骤1)所得的上清液Ⅲ按步骤3)方法测定上清液中各硝基呋喃类药物、峰面积及其定量定性离子对，根据各出峰时间以及定性定量离子对丰度比进行定性分析，按照步骤3)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中各硝基呋喃类药物代谢产物的含量。2.根据权利要求1所述的测定动物胶类中药中的四种硝基呋喃类药物代谢产物残留的方法，其特征是：所述4种硝基呋喃类药物代...

【专利技术属性】
技术研发人员：励炯，贾彦博，孙岚，王红青，林伟杰，
申请(专利权)人：杭州市食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：浙江,33