一种抗菌肽-壳聚糖复合物、其制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种经过用SEQ ID Nos.1‑4所示的抗菌肽修饰的壳聚糖的抑菌材料及其制备方法。具体地，本发明专利技术提供一种抗菌肽‑壳聚糖复合物，其中抗菌肽上的羧基和壳聚糖上的氨基通过酰化反应发生偶联。抗菌肽修饰的壳聚糖材料具有显著的抑菌效果，能显著抑制金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌或大肠杆菌。同时公开了以该材料加载的细胞生长因子制成的纳米粒及其制备方法。以所述纳米粒为原料复合其它辅料所制成的化妆品或护肤品具有抑制痤疮生长及修复痤疮破损皮肤的作用。

Antibacterial peptide chitosan complex, preparation method and application thereof

The invention discloses a bacteriostatic material modified by SEQ peptide ID Nos.1 Nos.1 4, and a preparation method thereof. Specifically, the invention provides an antibacterial peptide chitosan complex, wherein the carboxyl group on the antimicrobial peptide and the amino group on the chitosan are conjugated through the acylation reaction. Antibacterial peptide modified chitosan material has significant inhibitory effect, and can significantly inhibit Staphylococcus aureus, Staphylococcus, Propionibacterium acnes, or Escherichia coli. Meanwhile, nanoparticles made from the cell growth factor loaded with the material are disclosed and a preparation method thereof. The cosmetics or skin care products made from the nanoparticles as raw materials combined with other excipients can inhibit acne growth and repair acne skin.

【技术实现步骤摘要】
一种抗菌肽-壳聚糖复合物、其制备方法及其应用
本专利技术属于化妆品及护肤品领域。本专利技术公开了一种抗菌肽修饰的壳聚糖复合物，具体涉及一种用SEQIDNos.1-4所示的抗菌肽修饰的壳聚糖复合物，同时公开了以该材料加载的细胞生长因子制成的纳米粒及其制备方法。所述纳米粒可以进一步制备成水剂、乳剂、凝胶剂、脂质体等形态。
技术介绍
20世纪80年代，由瑞典科学家发现的一类具有抗菌活性的多肽称为“antimicrobialpeptides”，意为“抗微生物肽”。抗菌肽是由基因编码在核糖体内合成的多肽，不同种类的抗菌肽通常有共同的特点：短肽(30～60个氨基酸)，强阳离子性(等电点范围为8.9～10.7)，热稳定性好(100℃，15min)，分子质量约为4KD，无药物屏蔽且不影响真核细胞。当今，抗菌肽已经可以由原核生物到人类的大部分有机生物体中成功分离和分类。抗菌肽通常作用于细菌，在真核生物的天然免疫方面发挥着重要作用，被认为是古代进化中哺乳动物体内有效保留的免疫分子。由于全球抗生素药物的滥用，越来越多的细菌可能发展成为对传统抗生素耐药的菌株。人们迫切地寻找能够代替传统抗生素的药物，使得抗菌肽受到广泛的重视。壳聚糖(chitosan)是现代制药技术常用的载体，因其诸多优点现今在化妆品中也被广泛使用。壳聚糖是来源于甲壳素脱乙酰产物，一种无定形的半透明物质，无毒、无害、易生物降解，不污染环境，并且具有良好的吸附性、成膜性、吸湿性等特性。已有大量的研究证实壳聚糖及其衍生物具有广谱的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草杆菌和白色念珠菌等均具有抑制作用。早前的报道主要研究了分子量大小、脱乙酰度因素对于壳聚糖杀菌性的影响。近年来，人们逐渐发现了化学改性对于抗菌能力的正向增强作用。其中，大多数条件下，季铵化操作所获得的季铵化壳聚糖衍生物，其杀菌能力都在不同程度上得到了进一步加强。但其抗菌能力与分子量及pH值相关，其抗菌范围及抗菌效果未达到期望。
技术实现思路
本专利技术提供了一种抗菌肽修饰的壳聚糖复合物、其制备方法及其在化妆品中的应用。抗菌肽偶联壳聚糖在不改变其生物学特性的情况下提高了其抗菌活性，特别是在禁止添加抗生素的祛痘化妆品中得到广泛应用。具体而言，本专利技术提供一种抗菌肽-壳聚糖复合物，具体涉及一种用SEQIDNos.1-4所示的抗菌肽修饰的壳聚糖复合物，以及该复合物的制备方法，同时公开了以该复合物加载细胞生长因子制成的抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒及其制备方法。将所述抗菌肽-壳聚糖-细胞生长因子纳米粒进一步制备成水剂、乳剂、凝胶剂、膏霜等形态，可用于抗痤疮系列产品的开发利用。在第一方面，本专利技术提供一种抗菌肽偶联的壳聚糖复合物。其中，抗菌肽上的羧基和壳聚糖上的氨基通过酰化反应偶联。优选地，所述抗菌肽通过其上的羧基与壳聚糖上的氨基发生酰化反应，从而使所述抗菌肽与壳聚糖键合偶联。在下文中，将这种偶联有抗菌肽的壳聚糖复合物称为“抗菌肽-壳聚糖复合物”。其中，所述的抗菌肽为选自D-peptideA(氨基酸序列为RLYLRIGRR-NH2，SEQIDNo.1)、D-peptideB(氨基酸序列为RLRLRIGRR-NH2，SEQIDNo.2)、D-peptideC(氨基酸序列为ALYLAIRRR-NH2，SEQIDNo.3)或D-peptideD(氨基酸序列为RLLLRIGRR-NH2，SEQIDNo.4)中的一种或几种，优选D-peptideA和/或D-peptideB。在所述抗菌肽-壳聚糖复合物中，抗菌肽上的羧基和壳聚糖上的氨基通过酰化反应发生偶联，从而使抗菌肽与壳聚糖偶联。在制备抗菌肽-壳聚糖复合物的方法中，优选地，通过控制酰化反应中抗菌肽与壳聚糖的质量比为2∶1～1∶5，优选为1∶1，可以得到合乎需要的抗菌肽-壳聚糖复合物。并且，优选地，在酰化反应中，分别控制[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]∶[抗菌肽]的质量比和[N-羟基琥珀酰亚胺]∶[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]的质量比为0.8和2.75。所述抗菌肽可以通过标准的短肽合成技术人工合成，也可以商购得到。本领域技术人员应该理解，在所述抗菌肽-壳聚糖复合物中的“壳聚糖”是壳聚糖及其衍生物的统称。可以通过商购或化学合成途径获得适用于本专利技术的壳聚糖及其衍生物。所述抗菌肽-壳聚糖复合物中的壳聚糖部分可以选自壳聚糖、季铵盐化壳聚糖、磺酸化壳聚糖或磷酸化壳聚糖，并且它们的分子量为3.5～10KD。所述抗菌肽-壳聚糖复合物能够有效地抑制革兰氏阳性菌(G+)和阴性菌(G-)的生长，例如，但不限于，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白葡萄球菌(StaplylococcusAlbus)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)、大肠杆菌(E.coli)的生长。在第二方面，本专利技术还提供制备所述的抗菌肽-壳聚糖复合物的方法，其包括以下步骤：(1)称取50～100mg壳聚糖，溶解于10～50mLPBS缓冲液(pH6～7)，(2)精密称取50～100mg抗菌肽，溶解于10～30mLPBS缓冲液(pH6～7)，(3)精密称取40～100mgEDC-HCl(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和50～250mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入至步骤(2)制得的包含抗菌肽的PBS溶液中，4℃避光搅拌十分钟，活化羧基，(4)将步骤(1)制得的壳聚糖溶液滴加入步骤(3)制得的包含抗菌肽、EDC-HCl和NHS的PBS溶液中，4℃避光搅拌过夜，(5)转移步骤(4)的溶液至截留分子量为6～8kDa的透析袋中，在4℃避光条件下用超纯水透析24h除去EDC-HCl、NHS和游离的壳聚糖，即得到所述抗菌肽-壳聚糖复合物。其中，在步骤(4)的偶联反应中，壳聚糖与抗菌肽的用量比(质量比)可以为2∶1～1∶5，优选为1∶1。优选地，在步骤(3)中，分别控制[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]∶[抗菌肽]的质量比和[N-羟基琥珀酰亚胺]∶[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]的质量比为0.8和2.75。所述方法还可以包括下述步骤：(6)将步骤(5)制得的抗菌肽-壳聚糖复合物冻干，-20℃保存待用。其中所用的抗菌肽为选自D-peptideA(氨基酸序列为RLYLRIGRR-NH2，SEQIDNo.1)、D-peptideB(氨基酸序列为RLRLRIGRR-NH2，SEQIDNo.2)、D-peptideC(氨基酸序列为ALYLAIRRR-NH2，SEQIDNo.3)或D-peptideD(氨基酸序列为RLLLRIGRR-NH2，SEQIDNo.4)中的一种或几种，优选D-peptideA(SEQIDNo.1)、D-peptideB(SEQIDNo.2)或二者的组合。所述抗菌肽-壳聚糖复合物中的壳聚糖部分可以选自壳聚糖、季铵盐化壳聚糖、磺酸化壳聚糖或磷酸化壳聚糖，并且，它们的分子量可以为3.5～10KD。可以通过商购或化学合成途径获得这些适用于本专利技术的壳聚糖及其衍生物。在所述抗菌肽-壳聚糖复合物中，抗菌肽上的羧基和壳聚糖上的氨基通过酰化反应发生偶联。在第三方面，本专利技术提供了一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌肽‑壳聚糖复合物，其中抗菌肽上的羧基和壳聚糖上的氨基通过酰化反应偶联。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽-壳聚糖复合物，其中抗菌肽上的羧基和壳聚糖上的氨基通过酰化反应偶联。2.权利要求1所述的抗菌肽-壳聚糖复合物，其中所述抗菌肽选自SEQIDNos.1-4所示的肽中的一种或几种。3.权利要求2所述的抗菌肽-壳聚糖复合物，其中所述抗菌肽为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2或它们的组合。4.权利要求1所述的抗菌肽-壳聚糖复合物，其中所述抗菌肽-壳聚糖复合物中的壳聚糖部分选自壳聚糖、季铵盐化壳聚糖、磺酸化壳聚糖或磷酸化壳聚糖，其中它们的分子量为3.5～10KD。5.一种制备权利要求1-4中任一项的抗菌肽-壳聚糖复合物的方法，所述方法包括下述步骤：(1)称取50～100mg壳聚糖，溶解于10～50mLpH6～7的PBS缓冲液，(2)精密称取50～100mg抗菌肽，溶解于10～30mLpH6～7的PBS缓冲液，(3)精密称取40～100mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和50～250mgN-羟基琥珀酰亚胺，加入至步骤(2)制得的包含抗菌肽的PBS溶液中，4℃避光搅拌十分钟，活化羧基，(4)将步骤(1)制得的壳聚糖溶液滴加入步骤(3)制得的包含抗菌肽、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的PBS溶液中，4℃避光搅拌过夜，(5)转移步骤(4)的溶液至截留分子量为6～8kDa的透析袋中，在4℃避光条件下，用超纯水透析24小时除去1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和游离的壳聚糖，即得到所述抗菌肽-壳聚糖复合物。6.根据权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄亚东，项琪，肖巧学，贝煜，
申请(专利权)人：肽源广州生物科技有限公司，广州暨南大学医药生物技术研究开发中心，
类型：发明
国别省市：广东,44