【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种在毕赤酵母中高效分泌表达全链长胶原蛋白的方法及其应用。
技术介绍
1、越来越多的研究表明，细胞外基质在器官发育以及维持组织正常生理状态过程中发挥了重要的作用。据统计，在发达国家约有45％的死亡病例与细胞外基质失调相关，如硬皮病、动脉粥样硬化、酒精肝等(biochemistry of collagens,laminins and elastin,academicpress,2016)。其中，胶原蛋白作为细胞外基质主要成分，更是发挥了举足轻重的作用。
2、迄今为止，已被发现的胶原有28种型号之多，按其结构可以分为纤维形成胶原、纤维形成辅助胶原、网状胶原，以及膜胶原。无论哪种胶原，都离不开三螺旋结构。与此同时，近年来非螺旋结构区域也引发了越来越多人的关注。天然胶原蛋白三股螺旋结构的形成的最初动力来自于端肽富含的半胱氨酸残基，半胱氨酸残基通过二硫键在胶原分子链束两端形成“扎口”，然后在分子间氢键作用力下，形成了类似麻花的三螺旋结构。
3、目前商品化的重组人源化胶原蛋白以片段或片段组合为主，大小从几kda至几十kda不等，这种“以偏概全”的做法并不能体现完整天然胶原蛋白的结构与功能优势。基于天然结构的重组人胶原蛋白及含端肽的胶原蛋白的开发应用具有着重要的意义。在众多表达宿主中，毕赤酵母以其易分泌、高表达的特点彰显出了无可比拟的产业化优势。但是，要在毕赤酵母中实现大分子蛋白的高效分泌表达，迄今为止，都属于一件并不容易的事。
4、综上可知，如何实现大分子蛋白的高效分泌表达
技术实现思路
1、基于此，本专利技术提供了一种在毕赤酵母中高效分泌表达全链长胶原蛋白的方法及其应用。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案具体如下：
3、一种在毕赤酵母中高效分泌表达全链长胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
4、s1、pcr扩增获得胶原蛋白氨基酸序列对应的核苷酸序列与线性化载体片段ppic9k；
5、s2、利用无缝克隆将步骤s1获得的胶原蛋白氨基酸序列对应的核苷酸序列与线性化载体片段ppic9k连接，获得重组载体；
6、s3、搜集毕赤酵母自身超过100kda分子量的分泌蛋白，通过将毕赤酵母自身信号肽与酿酒酵母α-杂交因子前导肽进行融合，筛选获得新的信号肽sigg；
7、s4、将步骤s3获得的新的信号肽sigg与步骤s2所得重组载体以无缝克隆的方式插入替换信号肽部分，构建载体，利用sacii将载体线性化，进一步电转化导入gs115，筛选出感受态细胞；
8、s5、构建分子伴侣表达载体ppiczaa-sh1，并将其导入步骤s4筛选出的感受态细胞中进行表达，即得。
9、优选地，所述在毕赤酵母中高效分泌表达的全链长胶原蛋白为包含成熟链前后的端肽。
10、优选地，所述包含成熟链前后的端肽包括i型、ii型、iv型、v型、vi型、vii型、viii型、ix型、x型、xi型、xii型、xiii型、xiv型、xv型、xvi型、xvii型、xviii型、xiv型、xx型、xxi型、xxii型、xxiii型、xxiv型、xxv型、xxvi型、xxvii型。
11、优选地，步骤s3所述新的信号肽sigg的核苷酸序列如seq id no.1所示。
12、atgtctttttcttctaacgttccacaattgtttttgttgttggttttgttgactaacattgtttctggtgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctctcgagaaaaga(seq id no.1)；
13、优选地，步骤s5所述的分子伴侣表达载体ppiczaa-sh1的构建过程如下：
14、(1)利用pcr扩增获得shi片段；
15、(2)将步骤(1)获得的shi片段线性化，并通过酶切连接的方式连入ppiczaa载体，构建分子伴侣表达载体ppiczaa-sh1。
16、优选地，步骤(1)中pcr扩增时，引物为f4、r4，所述引物f4的序列信息如seq idno.2所示；所述引物r4的序列信息如seq id no.3所示。
17、taattattcgaaacgatgaggtctttgttgttg(seq id no.2)；
18、ggcggccgctcattacaattcatc(seq id no.3)；
19、优选地，所述shi片段的核苷酸序列信息如seq id no.4所示。
20、atgaggtctttgttgttgttgtctgctttttgtttgttggaagctgctttggctgctgaagttaagaagccagctgctgctgctgctccaggtactgctgaaaagttgtctccaaaggctgctactttggctgaaaggtctgctggtttggctttttctttgtaccaagctatggctaaggatcaagctgttgaaaacattttggtttctccagttgttgttgcttcttctttgggtttggtttctttgggtggtaaggctactactgcttctcaagctaaggctgttttgtctgctgaacaattgagagatgaagaagttcatgctggtttgggtgaattgttgaggtctttgtctaactctactgctagaaacgttacttggaagttgggttctagattgtacggtccatcttctgtttcttttgctgatgattttgttaggtcttctaagcaacattacaactgtgaacattctaagattaactttagagataagcgatctgctttgcaatctattaacgaatgggctgctcaaactactgatggtaagttgccagaagttactaaggatgttgaaagaactgatggtgctttgttggttaacgctatgttttttaagccacattgggatgaaaagtttcatcataagatggttgataacagaggttttatggttactaggtcttacactgttggtgttatgatgatgcatagaactggtttgtacaactactacgatgatgaaaaggaaaagttgcaaattgttgaaatgccattggctcataagttgtcttctttgattattttgatgccacatcatgttgaaccattggaaagattggaaaag本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种在毕赤酵母中高效分泌表达全链长胶原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在毕赤酵母中高效分泌表达的全链长胶原蛋白为包含成熟链前后的端肽。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述包含成熟链前后的端肽包括I型、II型、IV型、V型、VI型、VII型、VIII型、IX型、X型、XI型、XII型、XIII型、XIV型、XV型、XVI型、XVII型、XVIII型、XIV型、XX型、XXI型、XXII型、XXIII型、XXIV型、XXV型、XXVI型、XXVII型。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3所述新的信号肽SigG的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S5所述的分子伴侣表达载体pPICZaA-SH1的构建过程如下：
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中PCR扩增时，引物为F4、R4，所述引物F4的序列信息如SEQ ID NO.2所示；所述引物R4的序列信息如SEQ ID NO.3所示。<...
【技术特征摘要】
1.一种在毕赤酵母中高效分泌表达全链长胶原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在毕赤酵母中高效分泌表达的全链长胶原蛋白为包含成熟链前后的端肽。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述包含成熟链前后的端肽包括i型、ii型、iv型、v型、vi型、vii型、viii型、ix型、x型、xi型、xii型、xiii型、xiv型、xv型、xvi型、xvii型、xviii型、xiv型、xx型、xxi型、xxii型、xxiii型、xxiv型、xxv型、xxvi型、xxvii型。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步...
【专利技术属性】
技术研发人员：张齐，梁清莲，吴旭伟，梁凤婷，
申请(专利权)人：肽源广州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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