一种紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝物种间分子鉴定的方法技术

本发明专利技术涉及一种紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝物种间分子鉴定的方法，具体以根据中国沿海三种常见贻贝紫贻贝、厚壳贻贝和翡翠贻贝的核糖体基因18S rRNA的SNP位点差异，设计一对特异性引物ZHF‑18S‑F/R，可利用高分辨率熔解曲线(HRM)技术对三种贻贝进行基因分型。本发明专利技术摆脱了靠表型进行鉴别的局限性，从分子水平对贻贝品种进行鉴定，具有快速、高效、准确的优点，测序结果显示鉴定成功率为100％。

A molecular identification method for mussel Mytilus edulis, Mytilus edulis and jadeite mussel

The invention relates to a method for molecular identification of mussels, mussels and Mytilus viridis, in order to design a pair of specific primers, ZHF 18S F/R, based on the differences in the SNP loci of the ribosomal 18S rRNA of three common mussels in China's coastal mussels, mussels and jadeite mussels, which can be used for high resolution fusion. Curve (HRM) technique was used to genotyping three mussel species. The invention has free from the limitation of phenotypic identification, and identifies the varieties of mussels from the molecular level, which has the advantages of rapid, efficient and accurate. The results of sequencing show that the success rate of identification is 100%.

【技术实现步骤摘要】
一种紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝物种间分子鉴定的方法
本专利技术属于贝类鉴定
，尤其涉及一种可用于紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝之间鉴定的方法。
技术介绍
贻贝属于软体动物门(Mollusca)，双壳纲(Bivalvia)，异柱目(Anisomyaria)，贻贝科(Mytilidae)，广泛分布于温带和亚北极地区的潮间带。我国是贻贝养殖大国，2015年总产量达到84.5万余吨，位居贝类养殖产量的前列，其中主要以养殖和出口紫贻贝(Mytilusedulis)、厚壳贻贝(Mytiloida)和翡翠贻贝(Linnaeus)这三种经济贝类为主。然而光中国沿海就有超过50多种贻贝，贻贝品种间在浮游期、稚贝期外形相似，且自然杂交个体、脱壳贩卖个体、表型受环境塑造后的个体，单凭外形较难区分。开发一套高效实用的贻贝品种鉴定方法，将为贻贝的生产育苗、科学研究和市场整顿提供有力的依据。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝物种间分子鉴定的方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为:该紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝物种间分子鉴定的方法，其特征在于：以紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝的基因组DNA为模板，根据紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝的基因组的标签序列设计引物进行PCR扩增，利用扩增产物在高分辨率熔解曲线中的Tm值差异进而区分；以待鉴定紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝的基因组DNA为模板，根据紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝的基因序列设计引物进行PCR扩增，利用扩增产物在高分辨率熔解曲线中的Tm值差异进而区分贝类相近物种，其序列扩增引物为：ZHF-18S-F:CGTAGTTGGATCTCGGGTZHF-18S-R:AAACCGGGAGGTAGGTCAGG。进一步地，所述的翡翠贻贝的SNP目标扩增片段为CGTAGTTGGATCTCGGGTCCCAGGCTTGCGGTCCGACGCACGTCGGTTTACTGCTTGTCCTGACCTACCTCCCGGTTT。进一步地，所述紫贻贝的SNP目标扩增片段为CGTAGTTGGATCTCGGGTCCCAGGCTGGCGGTCCGACGCCTGTCGGTTTACTGCCTGCTCCTGACCTACCTCCCGGTTT。进一步地，所述的厚壳贻贝的SNP目标扩增片段为CGTAGTTGGATCTCGGGTCCCAGGCTTGCGGTCCGACGCCTGTCGGTTTACTGCTCGTCCTGACCTACCTCCCGGTTT。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：1、操作简单灵活：只需要一个加入饱和荧光染料的PCR反应体系和一台常规的实时荧光定量PCR仪器(可加装高分辨率熔解分析模块)，不需要PCR后产物的分离，真正实现了闭管操作，避免了污染的可能性；2、高通量：能在一台荧光定量PCR仪上在2个小时内实现96甚至384个未知样本的鉴定工作；3、结果准确直观：不用进行测序和序列比对等步骤，不同物种之间DNA水平的差异以直观的峰图或者溶解曲线形式表现出来，极易区分辨别，鉴定结果与测序结果一致。附图说明图1为本专利技术实施例提供的贝类近缘物种鉴定高分辨率熔解曲线图(其中横坐标为温度℃)，纵坐标为荧光强度的对数值；每条曲线的最高点所对应的横坐标即为该曲线对应的PCR产物的Tm值)。具体实施方式以下通过结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术在依靠核酸序列区别而进行物种鉴定的过程中引入高分辨率熔解曲线方法，仅用一对PCR引物将不同物种在DNA水平上的差异转化成更直观的熔解曲线。其步骤为：a、物种鉴定依据序列的获得：从已有数据库或其它来源获得能够区分目标物种的依据序列(如COI基因序列等生物标签序列)；b、引物设计：比对不同物种之间依据序列的差异，寻找能够明显区分目标物种的区域，利用primerpremier5软件在该区域内设计PCR扩增引物，使扩增产物在不同物种间应有明显序列差异(即Tm值不同)，主要体现为G、C含量不同；c、PCR扩增：以待鉴定目标贻贝类的基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增；d、产物检测及处理：利用1％琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR扩增产物，确定扩增产物单一，无非特异性扩增后，每个反应添加1μl核酸饱和染料LC-green(Idaho，美国)，在普通PCR仪上运行95℃变性10min后冷却至室温。e、高分辨率熔解曲线(HRM)分析:上述产物在480实时定量分析仪(RocheDiagnostics)上进行HRM的运行，结束后利用平台上的分析软件获得产物熔解曲线，通过产物的熔接曲线来区分不同物种。PCR扩增引物退火温度在50℃-60℃之间，PCR产物长度控制在40bp-100bp之间。PCR扩增引物内尽量避免包含SNP位点和In/del，PCR产物序列在待鉴定的不同目标物种之间有明显的Tm值差异。PCR扩增程序为：95℃(预变性10min)，95℃(变性15sec)，Tm(复性15sec)，72℃(延伸30sec)变性、复性、延伸三步共循环44次后72℃后延伸10min，16℃(降温)结束。用于物种鉴定的依据序列可以根据需要自由选择针对不同物种最优的参照序列，可以是COI基因序列或其他符合生物标签特征的序列。实施例1贻贝类中紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝的鉴定：a、物种鉴定依据序列的获得和比对分析在NCBI数据库中获得上述四种贻贝的18SrRNA序列，使用AlignX(acomponentofVectorNTISuite7.1)软件进行序列比对，寻找在三种贻贝中存在碱基差异的区域。b、引物设计与筛选引物设计应满足以下条件：目标扩增序列在50-150bp之间；为使熔解温度不同，序列之间存在GC碱基含量的差异；退火温度(Tm)应在50-60℃之间；正反引物之间应尽量避免错配、发夹结构和引物二聚体；引物由上海生工工程有限责任公司合成。随机选择5个所对应的贻贝DNA样本作为模板，使用琼脂糖凝胶电泳技术对引物进行初步筛选，选择能扩增出明亮、单一条带的引物组合进行HRM分析。c、HRM分析使用480饱和荧光染料HRM试剂盒，包含：10μL480HRMMasterMixwithdye(RocheDiagnostics)，正反引物各10μmol，30ngDNA模板，1.6μLMgcl2，补水至20μL。PCR反应和产物的熔解曲线分析同时在480实时定量分析仪(RocheDiagnostics)上进行。正向引物ZHF-18S-F:CGTAGTTGGATCTCGGGT；反向引物ZHF-18S-R:AAACCGGGAGGTAGGTCAGG。反应程序如下：PCR扩增程序依照：95℃(预变性30sec)，95℃(变性30sec)，Tm(复性30sec)，72℃(延伸30sec)变性、复性、延伸三步共循环45次后72℃后延伸10min，16℃(降温)结束。PCR扩增结束后，程序自动运行高分辨率熔解曲线程序，每升高1℃采集荧光25次。使用480上自带的TmCalling和GeneScanningSoftware1.5软件进行Tm值分析和基因分型。d、产物检测及处理：将上述PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，确定扩增产物单一后，每个反应添加1ulLC-green，在普本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝物种间分子鉴定的方法，其特征在于：以紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝的基因组DNA为模板，根据紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝的基因组的标签序列设计引物进行PCR扩增，利用扩增产物在高分辨率熔解曲线中的Tm值差异进而区分；以待鉴定紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝的基因组DNA为模板，根据紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝的基因序列设计引物进行PCR扩增，利用扩增产物在高分辨率熔解曲线中的Tm值差异进而区分贝类相近物种，其序列扩增引物为：ZHF‑18S‑F:CGTAGTTGGATCTCGGGT；ZHF‑18S‑R:AAACCGGGAGGTAGGTCAGG。

【技术特征摘要】
1.一种紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝物种间分子鉴定的方法，其特征在于：以紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝的基因组DNA为模板，根据紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝的基因组的标签序列设计引物进行PCR扩增，利用扩增产物在高分辨率熔解曲线中的Tm值差异进而区分；以待鉴定紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝的基因组DNA为模板，根据紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝的基因序列设计引物进行PCR扩增，利用扩增产物在高分辨率熔解曲线中的Tm值差异进而区分贝类相近物种，其序列扩增引物为：ZHF-18S-F:CGTAGTTGGATCTCGGGT；ZHF-18S-R:AAACCGGGAGGTAGGTCAGG。2.根据权利要求1所述的紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝物种间分子鉴定的方法，其特征在于所述的翡翠贻贝的SNP目标扩增片段为CGTAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈兴强，李荣华，王春琳，母昌考，宋微微，刘磊，詹萍萍，史策，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33