本发明专利技术提供一株能够通过生物转化生产天然δ‑癸内酯的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NPP01及其还原马索亚内酯制备δ‑癸内酯的应用。本发明专利技术所述恶臭假单胞菌NPP01具有高产δ‑癸内酯、底物转化率高、培养条件简单等优良特性。在上述培养方法下，δ‑癸内酯的产量达到9.2g/L以上，底物转化率达到90％以上。经气相色谱—质谱联用技术分析检测培养液中的δ‑癸内酯，结果表明产物的结构、分子量与δ‑癸内酯标准品一致。
Pseudomonas putida NPP01 and its application in the preparation of delta decyl lactone
The invention provides an application of a Pseudomonas putida NPP01 and its reduction Malo lactone to prepare delta decyl ester by bioconversion of natural delta decyl ester. The Pseudomonas putida NPP01 has excellent characteristics of high yield of delta decyl lactone, high substrate conversion rate and simple culture conditions. Under the above culture method, the yield of 9.2g/L is over 90%, and the substrate conversion rate is over. The determination of delta decyl ester in the medium by gas chromatography - mass spectrometry (GC - MS) shows that the structure and molecular weight of the product are in accordance with the standard of delta decyl ester.
【技术实现步骤摘要】
恶臭假单胞NPP01及其在制备δ-癸内酯中的应用(一)
本专利技术属于生物技术微生物领域，具体涉及一株能够通过生物转化生产天然δ-癸内酯的恶臭假单胞菌菌株及其应用。(二)
技术介绍
δ-癸内酯，即丁位癸内酯，又称δ-正戊基-δ-戊内酯或5-羟基癸酸内酯。具有强烈持久的奶油香特征，是调制牛奶和奶油香精的重要原料，同时也广泛用于调配椰子、草莓、桃等香料，在人造奶油、冰淇淋、软饮料、糖果、焙烤食品及调味料中大量应用，市场需求量非常大。传统的δ-癸内酯生产工艺为化学合成，即用过酸将5-戊基环戊酮氧化制得。由于化学合成途径存在反应条件苛刻、副产物难以去除、产品缺乏自然温和的奶油香味等弊端，有关食品添加剂和药品添加剂的法规严格限制化学合成产品的使用。同时，随着消费者对天然产品需求的上升，从天然材料中获取天然香料或使用微生物转化技术生产天然香料，成为香料工业的重要趋势。而天然原料中的香料成分含量普遍较低，受地域、季节、气候等因素制约较大，使得天然提取途径的成本高昂，实际应用受到很大限制。微生物法是生产安全的、高生物活性的香味化合物及其复合物最有前途的方法。微生物法生产的香料气味更为自然、纯正，与天然提取的产品品质不相上下，且这一方法生产的δ-癸内酯具有旋光活性，在香料行业有特殊用途，使其更具有研究和实用价值。(三)
技术实现思路
为了解决上述的技术问题，本专利技术的第一个目的是提供一株恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)NPP01菌株，其具有通过微生物转化将马索亚内酯还原成δ-癸内酯的特性。本专利技术的第二个目的是提供上述的恶臭假单胞菌NPP01在制备δ-癸内酯中的应用。本专利技术采用的技术方案：第一方面，本专利技术提供一株新菌株--恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)NPP01，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO：M2017473，保藏日期为2017年09月06日，邮编430072。本专利技术从浙江省各地收集的土壤样本中分离纯化获得430株微生物菌株，经筛选获得1株能够高效地转化马索亚内酯为δ-癸内酯的菌株。该菌株的形态特征：在LB固体培养基上培养1d，形成半透明乳白色扁平菌落；表面光滑(图1)；显微镜下细胞呈长杆状，运动活泼，长约2～3微米。通过16SrDNA序列分析比对，结果显示该菌株与恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)吻合(图2)。根据形态特征和16SrDNA序列比对，鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)NPP01。第二方面，本专利技术还提供一种恶臭假单胞菌NPP01在还原马索亚内酯制备δ-癸内酯中的应用，所述的应用为：以恶臭假单胞菌NPP01经扩增培养获得的种子液为反应介质，添加质量终浓度0.5～20％大豆油(优选5％)和质量终浓度0.1～15％马索亚内酯(优选1％)，150r/min，30℃摇床培养48～60h，获得含δ-癸内酯的培养液，将培养液分离纯化，获得δ-癸内酯。进一步，所述种子液按如下方法制备：(1)将恶臭假单胞菌NPP01接种至LB固体培养基上，30℃倒置培养1～2d，获得斜面菌体；所述LB固体培养基质量组成为：蛋白胨0.1～5％、酵母粉0.05～3％、氯化钠0.1～2％、琼脂2％，溶剂为水，pH6.5～7.0；优选LB固体培养基质量组成为：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化钠1％、琼脂2％，溶剂为水，pH6.5～7.0；(2)挑取斜面菌体转接于液体培养基M，150r/min，30℃扩增培养20～24h，制得种子液；所述液体培养基M质量组成为：蛋白胨0.1～8％、酵母粉0.05～3％、氯化钠0.1～2％、硫酸镁0.001～0.05％，溶剂为水，pH6.5～7.0；优选液体培养基M质量组成为：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化钠1％、硫酸镁0.01％，溶剂为水，pH6.5～7.0。本专利技术所述培养液分离纯化采用树脂吸附等方法，所述马索亚内酯化学名称为(R)-5,6-二氢-6-戊基-2H-吡喃-2-酮。本专利技术所述大豆油购自浙江新市油脂股份有限公司生产的“如意”牌一级大豆油，生产日期为20170516。大豆油含60％左右亚油酸，30％左右油酸，及其他少量脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、亚麻酸等。使用前用0.22μm滤膜过滤除菌，后添加到培养基中。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术所述恶臭假单胞菌NPP01具有高产δ-癸内酯、底物转化率高、培养条件简单等优良特性。在上述培养方法下，δ-癸内酯的产量达到9.2g/L以上，底物转化率达到90％以上。(国内目前的普遍工艺是化学合成δ-癸内酯，如利用冬青油，即水杨酸甲酯为原料，经过化学反应合成。但此方法合成的δ-癸内酯产品也没有旋光性、无手性，不符合欧标天然的要求。马索亚内酯是有100％的R型手性碳，通过生物加氢反应可直接得到手性的丁位癸内酯，符合欧标天然的要求)经气相色谱—质谱联用技术分析检测培养液中的δ-癸内酯，结果表明产物的结构、分子量与δ-癸内酯标准品一致。(四)附图说明图1恶臭假单胞菌NPP01菌株在固体LB培养基上培养1d菌落正面。图2恶臭假单胞菌NPP01菌株鉴定结果与相关种的系统发育树。图3恶臭假单胞菌NPP01菌株转化培养液气相色谱—质谱检测图，A是气相色谱检测图，B是气相色谱—质谱检测图，上方为样品图，下方为标准品图。(五)具体实施方式下面对本专利技术具体实施方式做一个详细的说明。实施例1恶臭假单胞菌NPP01菌株的筛选鉴定1培养基1.1LB固体培养基质量终浓度组成：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化钠1％、琼脂2％、水1L，pH6.5～7.0。1.2液体培养基M质量终浓度组成：蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化钠1％、硫酸镁0.01％，溶剂为去离子水，pH6.5～7.0。2实验方法2.1高产δ-癸内酯菌株的分离纯化、筛选步骤1：分别从浙江省各地收集的不同土壤样本中称取适量土样，放入装有无菌水的摇瓶中，震荡摇匀片刻，取少量土壤浸出液，用无菌水稀释成不同浓度后，吸取50μL涂布于LB固体培养基上。30℃培养1～2d。选择菌落分布均匀，数量适中的平板，挑取不同表型特征的单菌落，分别划线于新鲜的LB固体培养基上进行纯化培养。获得的单菌落再次转接至新鲜的LB固体培养基进行纯化，获得性状均一的纯菌株。将分离纯化获得的各个菌株编号保存于20％甘油中，置于-20℃冰箱中保存备用。步骤2：将分离纯化获得的菌株接种在LB固体培养基上活化1～2d，挑取少量菌落接入液体培养基M，150r/min，30℃扩增培养20～24h，制得种子液。步骤3：向上述种子液中加入质量终浓度5％过滤灭菌的大豆油和质量终浓度1％马索亚内酯，150r/min，30℃摇床培养48～60h。步骤4：取适量上述培养液，加入等体积的乙酸乙酯抽提，离心后取上清液，采用气相色谱法检测底物马索亚内酯和产物δ-癸内酯的浓度，筛选产δ-癸内酯的菌株。气相色谱条件：GC2014，色谱柱RTX-1(30m×0.25mm×0.25μm)，FID检测器。进样口温度240℃，检测器250℃，柱温：100℃平衡1min，以20℃/min上升至200℃，保本文档来自技高网...
【技术保护点】
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NPP01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2017473，保藏日期为2017年09月06日，地址中国武汉，武汉大学，邮编430072。
【技术特征摘要】
1.恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)NPP01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2017473，保藏日期为2017年09月06日，地址中国武汉，武汉大学，邮编430072。2.一种权利要求1所述恶臭假单胞菌NPP01在还原马索亚内酯制备δ-癸内酯中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以恶臭假单胞菌NPP01经扩增培养获得的种子液为反应介质，添加质量终浓度0.5～20％大豆油和质量终浓度0.1～15％马索亚内酯，150r/min，30℃摇床培养48～60h，获得含δ-癸内酯的培养液，将培养液分离纯化，获得δ-癸内酯。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述种子液按如下方法制备：(1)将恶臭假单胞菌NPP01接种至LB固体培养基上，30℃倒置培养1～2d，获得斜面菌体；所述LB固体培养基质量组成为：蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪琨，朱廷恒，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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