一种结核病检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测结核病的试剂盒及检测方法，该试剂盒包括ESAT‑6与CFP‑10的蛋白混合液和抗人IFNg抗体。本发明专利技术应用基于IFNg相关的TNFa释放，建立一种区分活动性与潜伏性结核感染的方法，通过TNFa‑ELISA定量检测结核特异性抗原ESAT‑6/CFP‑10刺激条件下外周血单个核细胞释放的TNFa，在IFNg抗体存在情况下结核特异性抗原ESAT‑6/CFP‑10刺激条件下外周血单个核细胞释放的TNFa，以及非刺激情况下外周血单个核细胞释放的本底TNFa，通过比较不同条件下TNFa值，从而对活动性结核病进行直接诊断。

A detection kit and method for detection of tuberculosis

The present invention discloses a kit and detection method for detecting tuberculosis, which includes a protein mixture of ESAT 6 and CFP 10 and an anti human IFNg antibody. The invention is based on the IFNg related TNFa release to establish a method to distinguish between active and latent tuberculosis infection, and to detect the TNFa of the peripheral blood mononuclear cells under the 10 stimulation condition of the tuberculous specific antigen ESAT 6/CFP ELISA by the quantitative detection of the tuberculous specific antigen of ESAT, and the tuberculosis specific antigen ESAT 6/CFP of 6/CFP 10 under the presence of IFNg antibody. The TNFa released by peripheral blood mononuclear cells under stimulation, as well as the background TNFa released from peripheral blood mononuclear cells under non stimulation conditions, can be directly diagnosed by comparing TNFa values under different conditions.

【技术实现步骤摘要】
一种结核病检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及医学免疫学领域，涉及结核病人以及结核杆菌感染的快速特异性检测的方法。具体涉及的是IFNg抗体在抗原特异性TNFa检测试剂盒的应用，特别是在结核病检测中的应用以及新型的结核病检测试剂盒的制作和应用方法。
技术介绍
结核病是重要的全球公共卫生问题，严重危害人类健康，每年导致世界上约2百万人的死亡。结核病的早期诊断及有效治疗是结核病防治工作的重中之重，对于控制结核菌传播有着重要的临床意义。目前在临床上对结核病的诊断主要依据临床症状，胸部X光片及细菌学检查，例如结核菌涂片检查虽然简单易行且准确性高，但阳性率低。而结核菌培养检测结果可信度高，但耗时较长，不能满足临床需求。g-干扰素(IFNg)释放试验分析技术IGRA是一种用于结核杆菌感染的体外免疫检测的新方法。通过定量检测受检者外周血单个核细胞在结核分枝杆菌特异抗原刺激下释放的Y-1FN，从而对潜伏和活动性结核感染进行诊断。其基本原理是：结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，通过结核分枝杆菌特异性重组抗原刺激感染者效应T淋巴细胞增殖，并释放IFNg，通过检测IFNg水平，从而判断其是否具有针对结核分枝杆菌特异性的T细胞反应。该方法不受卡介苗（BCG）及非结核分枝杆菌影响，且其检测灵敏度和特异性均高。特异性好，同时灵敏度高,不受卡介苗接种和环境分枝杆菌的影响。但是，基于g-干扰素释放试验的方法虽然能对结核分枝杆菌感染进行快速诊断，但该方法却不能用于区分活动性与潜伏性结核感染。结核潜伏感染是指体内存在结核杆菌，无症状且痰中也无结核菌。结核病是指相关出现症状，X检查出现相应表现、曼托试验呈阳性或痰中检出结核菌。活动性结核患者应尽早给予治疗。中国是结核病大国，存在大量的潜伏性结核感染者，这类潜伏性结核感染人群可能终生都没有临床症状，也不需要进行任何治疗。由于g-干扰素释放试验的高灵敏性，除了活动性结核感染者之外，应用此方法检测潜伏性结核感染者也均为阳性，因此给临床用药带来困难。诊断如果能开发出只有活动性结核患者才表现为阳性，而潜伏性结核患者表现为阴性的检测方法，将对我国结核病诊断及治疗具有重要意义。外周血淋巴细胞受结核特异抗原刺激后产生的细胞因子也包括TNFa，申请公布号为CN103604933A公开基于抗原特异性TNF-a-ELISA检测活动性结核病的试剂盒及其应用，该专利声称基于其试剂盒，可以建立一种区分活动性和潜伏性结核感染的方法，通过ELISA技术定量检测结核特异性抗原ESAT-6和CFP-10刺激条件下外周血单个核细胞释放的TNF-a，以及非刺激情况下外周血单个核细胞释放的本底TNF-a，通过以上两者相减得到抗原特异性TNF-a值，从而对活动性结核病进行直接诊断。但是，业界以及本申请人多次重复该专利的方法并不能够很好的区分潜伏性和活动性结核感染，因此，单一的TNFa释放的指标是否可以作为活动性结核的标志还存在争议。本申请人利用ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液分别对健康人群（Healthy），潜伏感染人群(LTB)，以及活动性结核人群(TB)的外周血单个核细胞样本进行诱导后检测对应人群的TNF-a值，结果参见图1，从图1可见，LTB和TB人群的抗原特异性TNFa值明显高于健康人群，但是LTB和TB人群无显著差异。因此，单一的TNFa释放指标不能区分潜伏性和活动性结核。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够区分潜伏性和活动性结核感染的试剂盒及检测方法。本专利技术的一个目的是提供一种结核病检测试剂盒，其包括ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液和抗人IFNg抗体。根据一个实施方式，所述的结核病检测试剂盒还包括培养液。根据一个实施方式，所述的结核病检测试剂盒还包括植物凝集素、人TNFa检测试剂、TNFa蛋白标准品、生物素化的TNFa抗体、链亲核素-藻红蛋白交联物、样品稀释液。优选地，所述的ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液中ESAT-6与CFP-10的浓度分别为9~11微克/毫升。优选地，所述的抗人IFNg抗体的浓度为0.9~1.1毫克/毫升。优选地，所述的植物凝集素的浓度分别为9~11微克/毫升。本专利技术中，人TNFa检测试剂可以是ELISA试剂，可以化学发光检测试剂，也可以是其他试剂，在我们的优选例中，使用的是来自美国Biolegend的抗TNFa抗体荧光微球。本专利技术的第二个目的是提供一种所述的结核病检测试剂盒在检测结核病中的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种所述的结核病检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：步骤（1）、向待测样本中加入培养液，得到阴性对照组；步骤（2）、向待测样本中加入ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液，得到第一检测组；步骤（3）、向待测样本中加入ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液以及抗人IFNg抗体，得到第二检测组；步骤（4）、将所述的阴性对照组、所述的第一检测组和所述的第二检测组分别进行培养、检测得到各组待测样本中的TNFa浓度，其中，所述的阴性对照组的待测样本中的TNFa浓度记为A，所述的第一检测组的待测样本中的TNFa浓度记为B，所述的第二检测组的待测样本中的TNFa浓度记为C；步骤（5）、计算（B-A）/A的值和（C-B）/A的值，并根据所述的（B-A）/A的值和所述的（C-B）/A的值进行结果的判定。具体地，步骤（5）中进行结果判定的具体方法为：当所述的（B-A）/A的值≤1.5时,则结果判定为阴性无结核感染史；当所述的（B-A）/A的值>1.5且≤2时，则结果判定为可疑结核感染；当所述的（C-B）/A的值>2且所述的（B-A）/A的值>2时，且则结果判定为潜伏性结核感染；当所述的（C-B）/A的值≤-2且所述的（B-A）/A的值>2时，且则结果判定为活动性结核。优选地，所述的检测方法还包括向待测样本中加入植物凝集素得到阳性对照组，对所述的阳性对照组进行培养、检测得到阳性对照组的待测样本中的TNFa浓度的步骤。进一步优选地，当所述的阳性对照组的待测样本中的TNFa浓度>50pg/mL时，则标本符合要求，能够进行检测结果的判定。具体地，所述培养的条件为：在37℃、5%CO2的培养箱中培养16~20小时。具体地，所述检测的具体方法包括依次进行的如下步骤：步骤（1）、收集各组培养后的上清液，用样品稀释液进行稀释；用样品稀释液将TNFa蛋白标准品稀释至多个浓度梯度；然后分别加入人TNFa检测试剂，在24~26℃下密封混合50~70min；步骤（2）、真空去除液体；步骤（3）、加入所述的样品稀释液，继续真空去除液体；步骤（4）、加入生物素化的TNFa抗体，在24~26℃下密封混合50~70min，然后加入链亲核素-藻红蛋白交联物，继续混合25~35min；步骤（5）、重复进行步骤（3）；步骤（6）、加入所述的人TNFa检测试剂并进行悬浮后进行读数；步骤（7）、通过多个浓度梯度的TNFa蛋白标准品的读数绘制标准曲线，并将各组的读数通过所述的标准曲线换算成各组的待测样本的TNFa浓度。优选地，所述的阴性对照组中所述的待测样本与所述的培养液的投料体积比为1:0.5~0.6。优选地，所述的第一检测组还添本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核病检测试剂盒，其特征在于：其包括ESAT‑6与CFP‑10的蛋白混合液和抗人IFNg抗体。

【技术特征摘要】
1.一种结核病检测试剂盒，其特征在于：其包括ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液和抗人IFNg抗体。2.根据权利要求1所述的结核病检测试剂盒，其特征在于：所述的结核病检测试剂盒还包括培养液。3.根据权利要求1或2所述的结核病检测试剂盒，其特征在于：所述的结核病检测试剂盒还包括植物凝集素、人TNFa检测试剂、TNFa蛋白标准品、生物素化的TNFa抗体、链亲核素-藻红蛋白交联物、样品稀释液。4.根据权利要求3所述的结核病检测试剂盒，其特征在于：所述的ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液中ESAT-6与CFP-10的浓度分别为9~11微克/毫升；所述的抗人IFNg抗体的浓度为0.9~1.1毫克/毫升；所述的植物凝集素的浓度分别为9~11微克/毫升。5.一种如权利要求1至4中任一项所述的结核病检测试剂盒在检测结核病中的应用。6.一种如权利要求1至4中任一项所述的结核病检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1）、向待测样本中加入培养液，得到阴性对照组；步骤（2）、向待测样本中加入ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液，得到第一检测组；步骤（3）、向待测样本中加入ESAT-6与CFP-10的蛋白混合液以及抗人IFNg抗体，得到第二检测组；步骤（4）、将所述的阴性对照组、所述的第一检测组和所述的第二检测组分别进行培养、检测得到各组待测样本中的TNFa浓度，其中，所述的阴性对照组的待测样本中的TNFa浓度记为A，所述的第一检测组的待测样本中的TNFa浓度记为B，所述的第二检测组的待测样本中的TNFa浓度记为C；步骤（5）、计算（B-A）/A的值和（C-B）/A的值，并根据所述的（B-A）/A的值和所述的（C-B）/A的值进行结果的判定。7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏小兵，彭艳春，李子剑，陈智杰，
申请(专利权)人：苏州因湃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32