基于微流控芯片的模拟体内代谢过程的肝-血脑屏障体系制造技术

一种基于微流控芯片的模拟体内代谢过程的肝‑血脑屏障体系，所述微流控芯片主要由顶层芯片、多孔滤膜、底层芯片组成。顶层芯片接种有肝细胞，可以模拟体内药物的肝代谢过程；底层芯片主要由左侧主通道和右侧主通道通过胶原通道连接，在胶原界面接种有脑胶质细胞层和脑微血管内皮细胞层可以模拟血脑屏障功能。本发明专利技术将体外血脑屏障模型的构建与表征、药物经肝代谢过程在屏障通透性的评价集成，可以用于血脑屏障模型的体外模拟及药物评价应用。本发明专利技术解决了细胞共培养模型二次接种和耗时长的问题，添加入流动条件，更符合体内真实环境，而且显著降低了细胞和试剂消耗量，并可以单次同时获得多个实验相关参数。

Liver blood brain barrier system based on microfluidic chip for simulating metabolic process in vivo

A microfluidic chip based blood brain barrier system that simulates the metabolic process in the body. The microfluidic chip is mainly composed of the top layer chip, the porous filter membrane and the bottom chip. The top chip is inoculated with hepatocytes, which can simulate the liver metabolism of the drug in the body. The underlying chip is connected mainly by the left main channel and the right main channel through the collagen channel. The brain glial cell layer and the cerebral microvascular endothelial cell layer can be inoculated in the collagen interface to simulate the blood brain barrier function. The invention integrates the construction and characterization of the blood brain barrier model in vitro, and the evaluation of the drug transhepatic metabolic process in the barrier permeability, which can be used in the simulation of the blood brain barrier model in vitro and the application of drug evaluation. The invention solves the problem of two inoculation and long time consuming of the cell co culture model, adding into the flow condition, more actual environment in the combination, and significantly reducing the consumption of cells and reagents, and obtaining a number of experimental parameters at the same time.

【技术实现步骤摘要】
基于微流控芯片的模拟体内代谢过程的肝-血脑屏障体系
本专利技术涉及将微流控芯片技术应用到体内组织工程的模拟与应用领域，具体涉及一种基于微流控芯片的模拟体内代谢过程的肝-血脑屏障体系。
技术介绍
动物实验在现代医学与生物学中占据了极为重要的位置，但是经费以及动物伦理也成了难以回避的问题。结合微流控技术与生物科学技术，创造出了一种“器官芯片”，能够用微芯片复制人体器官的功能，使医学实验变得更为简便。药物进入体内之后往往会经过吸收、分布、代谢、排泄等过程。药物自体外或给药部位经过细胞组成的屏蔽膜进入血液循环，通过门静脉进入肝脏，受到肝脏内药物代谢酶的影响，药物原型或代谢物经过血液循环迅速分布在各组织。肝脏作为人体的重要代谢器官，在药物的处置中发挥重要作用。1885年德国人PaulEhrlich第一次证明了脑血管的通透性与非神经性血管不同，其后的研究者们相继认识到血和脑之间有屏障存在，并称之为血-脑屏障。血脑屏障是一个以脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞共同构成的结构的和功能的屏障，它调节分子进出大脑以维持神经的微环境。很多脑内的疾病都与血脑屏障的防御功能被破坏有关，药物又无法顺利通过血脑屏障。因此，建立体外血脑屏障模型，研究血脑屏障的结构和功能特性、对各种化学成分的转运能力及其损伤和防御功能被破坏的机制，对于进一步研究血脑屏障的功能原理，认识脑部感染和药物的转运机制，以及由于屏障功能失效造成的脑损伤和疾病和如何进行药物治疗有着重大意义。细胞生物学发展至今，现有的体外血脑屏障的模拟方法主要集中于商品化的孔板或Transwell小室，研究二维层面血脑屏障模型的结构和功能，主要存在的问题是孔板或者Transwell小室很难在体外构建存在二维平面到三维空间的界面转换的血脑屏障模型，难以实现间充质干细胞穿越血脑屏障进行脑内肿瘤治疗的原位观察。微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代细胞研究的重要平台。它对于实验结果能够实时追踪和原位观察，不仅能够获得最终结果，也可以得到细胞迁移过程中出现的暂时性信息，为间充质干细胞穿越血脑屏障过程的研究提供常规分析中有可能缺失的重要生物学信息。而目前，利用微流控芯片进行间充质干细胞穿越血脑屏障，尤其是从二维平面迁移运动到三维基质过程的研究分析还处于空白阶段。微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代细胞研究的重要平台。应用微流控技术构建具有肝-脑功能的器官芯片模拟药物体内代谢过程，研究药物及其代谢产物在血脑屏障的通透性具有十分重要的优势和意义。目前，利用微流控技术构建具功能的复杂多器官芯片进行相关研究分析还处于空白阶段，如能实现在生物学研究及医药研发中具有极大的应用前景。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种基于微流控芯片的模拟体内代谢过程的肝-血脑屏障体系及其应用，该体系可以模拟体内代谢过程进行药物毒性评价，应用于药物经代谢后通透血脑屏障的药物评价。一种流控芯片，该微流控芯片主要由顶层芯片、多孔滤膜、底层芯片组成，多孔滤膜通过不可逆封接顶层芯片的下表面，封有顶层芯片的多孔滤膜下表面通过PDMS与底层芯片的上表面粘合封接；顶层芯片由U形的顶层芯片主通道和顶层芯片主通道入口连接而成，底层芯片由左侧主通道、右侧主通道、和胶原通道、胶原通道入口、底层芯片左侧主通道入口以及底层芯片右侧主通道入口组成，胶原通道左连左侧主通道，右连右侧主通道；顶层芯片主通道通过多孔滤膜下连底层芯片左侧主通道；底层芯片左侧主通道通过多孔滤膜上连顶层芯片主通道，右连胶原通道。所述底层芯片的左侧主通道为I形，所述底层芯片的右侧主通道为U型，所述底层芯片细胞胶原通道为“丰”字形，在胶原通道中间的位置上为横向结构，胶原通道通过横向结构与左侧通道和右侧通道相连接，横向结构的数量为1～10个。所述底层芯片是由高度不同的两部分组成，左侧主通道、右侧主通道高度为200-500μm，胶原通道高度为80-200μm，主通道高度：胶原通道高度为1～3:1。所述芯片材料为可透光透气的PDMS聚合物，PDMS单体与引发剂比例为5～10:1，多孔滤膜材料为聚碳酸酯膜，聚碳酸酯膜的孔径为0.01～10um。顶层芯片主通道和底层芯片右侧主通道设计为弯型，底层芯片左侧主通道和胶原通道设计为直型，这样，各通道入口能够相互避开，且具一定距离，不会影响操作，避免距离过近导致的接触污染。每层芯片的下表面和多孔滤膜为不可逆封接，每层芯片的上表面和多孔滤膜为PDMS粘合。本专利技术提供的微流控芯片的制备方法，不可逆封接方法为紫外活化1小时，硅烷化处理30分，氧等离子封接。PDMS粘合方法为使用单体与引发剂比例为20:1的PDMS聚合物，在玻片上甩10～50um厚，芯片上表面蘸取PDMS后，与已不可逆封接有顶层芯片的多孔滤膜对齐封接，放入80度烘箱，30分。一种基于微流控芯片的模拟体内代谢过程的肝-血脑屏障体系，采用上述微流控芯片，按照以下方法构建而成：(1)芯片预处理设计制作芯片，用移液器将配制好的胶原工作液加入胶原通道，加1mLPBS缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育30min，促使胶原由粘稠状液体变为果冻状凝胶，凝胶过程结束后，细胞主通道加入新鲜的细胞培养液；(2)细胞的接种与培养肝细胞调整至1～5×106cells/mL的细胞悬液，加入顶层芯片主通道，细胞贴附于多孔滤膜界面生长，将芯片平移放入37℃培养箱中继续培养、每隔24h换液一次；鼠脑胶质细胞经消化后，调整至1～5×105cells/mL的细胞悬液，取10μL细胞悬液加入底层芯片左侧主通道；当在光学显微镜下观察到细胞均匀分布时，立即将芯片竖立，并移入恒温培养箱中放置，竖立方向为左侧主通道在上，胶原通道在下；竖立放置8min后，取出观察，如果细胞紧贴于左侧主通道与胶原通道的胶原交界面，说明细胞接种成功；将芯片放平，移入恒温培养箱中继续培养12小时；鼠脑微血管内皮细胞经消化后如前法接种于胶质细胞层上，形成两层细胞屏障层。移入恒温培养箱中继续培养12小时；脑胶质瘤细胞(U87)或神经细胞经消化后，调整至1～5×106cells/mL的细胞悬液，取10μL细胞悬液加入底层芯片右侧主通道，将芯片平移放入37℃培养箱中继续培养、每隔24h换液一次；(3)待细胞生长状态良好，可进行后续试验；观察药物经代谢后对血脑屏障的通透效果以及对靶细胞的作用。一种基于微流控芯片的模拟体内代谢过程的肝-血脑屏障体系的应用，其特征在于：可采用上述体系，对药物经代谢后在血脑屏障通透性及对靶细胞的作用性进行评价，具体过程如下：(1)免疫荧光，常规免疫染色操作，ZO-1免疫染色，表征血脑屏障紧密连接情况；(2)小分子滤过，使用小分子荧光物质，加入左侧主通道，荧光显微镜下于不同时间点拍照，分析小分子物质的渗透性，表征血脑屏障模型的渗透性；(3)于顶层芯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片主要由顶层芯片、多孔滤膜、底层芯片组成，多孔滤膜通过不可逆封接顶层芯片的下表面，封有顶层芯片的多孔滤膜下表面通过PDMS与底层芯片的上表面粘合封接；顶层芯片由U形的顶层芯片主通道(1)和顶层芯片主通道入口(11)连接而成；底层芯片由左侧主通道(3)、右侧主通道(6)、胶原通道(7)、胶原通道入口(8)、底层芯片左侧主通道入口(9)以及底层芯片右侧主通道入口(10)组成，胶原通道(7)左连左侧主通道(3)，右连右侧主通道(6)；顶层芯片主通道(1)通过多孔滤膜(5)下连底层芯片左侧主通道(3)；底层芯片左侧主通道(3)通过多孔滤膜(5)上连顶层芯片主通道(1)，右连胶原通道(7)。

【技术特征摘要】
1.一种微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片主要由顶层芯片、多孔滤膜、底层芯片组成，多孔滤膜通过不可逆封接顶层芯片的下表面，封有顶层芯片的多孔滤膜下表面通过PDMS与底层芯片的上表面粘合封接；顶层芯片由U形的顶层芯片主通道(1)和顶层芯片主通道入口(11)连接而成；底层芯片由左侧主通道(3)、右侧主通道(6)、胶原通道(7)、胶原通道入口(8)、底层芯片左侧主通道入口(9)以及底层芯片右侧主通道入口(10)组成，胶原通道(7)左连左侧主通道(3)，右连右侧主通道(6)；顶层芯片主通道(1)通过多孔滤膜(5)下连底层芯片左侧主通道(3)；底层芯片左侧主通道(3)通过多孔滤膜(5)上连顶层芯片主通道(1)，右连胶原通道(7)。2.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述底层芯片的左侧主通道(3)为I形，所述底层芯片的右侧主通道(6)为U型，所述底层芯片细胞胶原通道(7)为“丰”字形，在胶原通道中间的位置上为横向结构，胶原通道通过横向结构与左侧通道(3)和右侧通道(6)相连接，横向结构的数量为1～10个。3.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述底层芯片是由高度不同的两部分组成，左侧主通道(3)、右侧主通道(6)高度为200-500μm，胶原通道(7)高度为80-200μm，主通道高度：胶原通道高度为1～3:1。4.按照权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述芯片材料为可透光透气的PDMS聚合物，PDMS单体与引发剂比例为5～10:1，多孔滤膜材料为聚碳酸酯膜，聚碳酸酯膜的孔径为0.01～10um。5.一种基于微流控芯片的模拟体内代谢过程的肝-血脑屏障体系，其特征在于：采用上述微流控芯片，按照以下方法构建而成：(1)芯片预处理设计制作芯片，用移液器将配制好的胶原工作液加入胶原通道，加1mLPBS缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育30min，促使胶原由粘稠状液体变为果冻状凝胶，凝胶过程结束后，细胞主通道加入新鲜的细胞培养液；(2)细胞的接种与培养肝细胞调整至1～5×106c...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦建华，郭雅琼，李中玉，许慧，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21