猪血中提纯杀菌性/通透性增加蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种从猪血中提取纯化杀菌性／通透性增加蛋白（简秒ＢＰＩ）的方法。该法为首先将猪血中纯化的ＰＭＮＬ采用冷冻法制取ＢＰＩ粗提液；再以大肠杆菌作为结合菌进行孵育、离心得到结合菌体；然后从结合菌体中分离出蛋白质；最后进行透析，离心得纯化ＢＰＩ。该法采用的设备简单，条件易控制，耗时短，污染度低，成本低，而且该法获得的ＢＰＩ经测试其纯化倍数及纯度已能满足临床需求，为其临床应用奠定了基础。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种蛋白质的提取纯化方法，尤其是一种从猪血中提取纯化杀菌性/通透性增加蛋白(简称BPI)的方法。已知BPI是一种存在于人及兔等哺乳动物中性粒细胞(简称PMNL)中的阳性蛋白质，是一种强有力的杀菌物质，具有特异杀灭革兰氏阴性菌及中和内毒素的活性，因此，人们欲从人及兔的PMNL中提取BPI，以期应用于临床，然而传统的BPI提纯方法为1.将人或兔的纯化PMNL采用研磨法破坏细胞膜，并用0.16N硫酸抽提得粗提液；2.将粗提液经过三次柱层析即葡聚糖G-75或G-50、葡聚糖C-50和葡聚糖G-100得到纯化的BPI。这种提取纯化法存在有不足之处1.原料资源匮乏，不易得；2.采用研磨法破坏细胞膜，污染度高；3.经过三次柱层析，工作量大，设备条件要求高且不易控制，耗时长达1-2周。由于上述原因，使其成本高，不易得，阻碍了它的价值发挥。本专利技术的目的在于提供一种简单、快捷、经济的BPI的提取纯化法。经研究发现，猪血的PMNL中存在有BPI，它是一带正电荷的蛋白质，它与G-菌外膜的内毒素带负电荷部分有很高的亲和力，这种亲和力大大超过与其他物质的亲和力，而且这种结合中的BPI可被高浓度Mg2+所取代下来。鉴于上述观点，本专利技术是这样实现的一种为首先将猪血中纯化的PMNL采用冷冻法制取BPI粗提液；再以大肠杆菌作为结合菌进行孵育、离心得到结合菌体；然后从结合菌体中分离出蛋白质；最后进行透析，离心得纯化BPI。其中所述BPI粗提液的制取是指将纯化的BPI进行冷冻，反复冻融三次或三次以上，并用0.16N硫酸抽提得PH为4.0的BPI粗提液。其中所速结合菌体的制法是指将大肠杆菌15菌置于PH4.0的BPI粗提液中，使其J5菌终浓度为5×108cfu/ml，在37℃条件下孵育10-15min，离心收集结合菌体。其中所述分离蛋白质的条件为将所得结合菌体置于PH4.0的缓冲液中，使结合菌体终浓度为5×109cfu/m1，37℃振荡孵育15min，在4℃，23000×g条件下离心20min，取上清，该上清为分离出的蛋白质。其中所述的透析、离心条件为将2000倍于上述上清体积的透析液中透析24小时，在4℃，23000×g条件下离心20min得纯化的BPI。其中所述结合菌体制法中所指的PH4.0缓冲液为200mMMgCl2/10mMHAc/NaAc。其中所述透析液是指10mMHAC/NaPH4.0缓冲液。该方法采用的设备简单，条件易控制，耗时短，时间不会超过48小时；采用冷冻法破坏细胞膜，将污染度降为最低，且较研磨法又节省了人力；猪血价廉易得，使其从原材料及设备均降低了成本，综上所述，这是一种简单、快捷、经济的提纯BPI的方法，从整体上降低了BPI的成本，而且该法获得的BPI经测试其纯化倍数及纯度已能满足临床需求，为其临床应用奠定了基础。下面结合实施例对本专利技术作进一步详述一种为首先将猪血中纯化的PMNL采用冷冻法制取BPI粗提液；再以大肠杆菌作为结合菌进行孵育、离心得到结合菌体；然后从结合菌体中分离出蛋白质；最后进行透析，离心得纯化BPI。其中所述BPI粗提液的制取是指将从猪血中纯化的PMNL进行冷冻，冷冻温度为0℃反复冻融三次，并用0.16N硫酸抽提得PH为4.0的BPI粗提液。其中所述结合菌体的制法是指将大肠杆菌J5菌置于PH4.0的BPI粗提液中，使J5菌终浓度为5×108cfu/ml，在37℃条件下孵育10-15min，用离心机在1000rpm×10min条件下离心收集结合菌体。其中所述分离蛋白质的条件为将所得结合菌体置于PH4.0的200mMMg(Gl2/10mMHAc/NaHAc缓冲液中，使结合菌体终浓度为5×109cfu/ml，37℃振荡孵育15min，在4℃，23000×g条件下离心20min，取上清，该上清为分离出的蛋白质。其中所述的透析、离心条件为将2000倍于上述上清的体积10mMHAc/NaACPH4.0缓冲液中透析24小时，在4℃，23000×g条件下离心20min得纯化的BPI。对所得的BPI与从猪血中PMNL按传统的柱层析法提纯的BPI测试进行对比，得表1表1.两种方法对比表<tables id="table1" num="001"><table width="804">蛋白获取量(％)杀菌活性*中和内毒素能力纯化倍数本专利技术0.10.7530.9103传统法0.10.0851.0170</table></tables>*杀菌活性为杀死90％3×107大肠杆菌所需蛋白的毫克数。权利要求1.一种，其特征在于首先将猪血中纯化的PMNL采用冷冻法制取BPI粗提液；再以大肠杆菌作为结合菌进行孵育、离心得到结合菌体；然后从结合菌体中分离出蛋白质；最后进行透析，离心得纯化BPI。2.如权利要求1所述的，其特征在于所述BPI粗提液的制取是指将猪血中纯化的PMNL进行冷冻，反复冻融三次或三次以上，并用0.16N硫酸抽提得PH为4.0的BPI粗提液。3.如权利要求1所述的，其特征在于所述结合菌体的制法是指将大肠杆菌15菌置于PH4.0的BPI粗提液中，使J5菌终浓度为5×108cfu/ml，在37℃条件下孵育10-15min，离心收集结合菌体。4.如权利要求1所述的，其特征在于所述分离蛋白质的条件为将所得结合菌体置于PH4.0的缓冲液中，使结合菌体终浓度为5×109cfu/ml，37℃振荡孵育15min，在4℃，23000×g条件下离心20min，取上清，该上清为分离出的蛋白质。5.如权利要求1所述的，其特征在于所述的透析、离心条件为将2000倍于上述上清体积的透析液中透析24小时，在4℃，23000×g条件下离心20min得纯化的BPI。6.如权利要求4所述的，其特征在于所述PH4.0缓冲液为200mMMgCl2/10mMHAc/NaAc。7.如权利要求5所述的，其特征在于所述的透析液为10mMHAc/NaAcPH4.0缓冲液。全文摘要本专利技术涉及一种从猪血中提取纯化杀菌性/通透性增加蛋白(简秒BPI)的方法。该法为首先将猪血中纯化的PMNL采用冷冻法制取BPI粗提液；再以大肠杆菌作为结合菌进行孵育、离心得到结合菌体；然后从结合菌体中分离出蛋白质；最后进行透析，离心得纯化BPI。该法采用的设备简单，条件易控制，耗时短，污染度低，成本低，而且该法获得的BPI经测试其纯化倍数及纯度已能满足临床需求，为其临床应用奠定了基础。文档编号C07K1/00GK1156726SQ96117850公开日1997年8月13日 申请日期1996年12月20日 优先权日1996年12月20日专利技术者周红 申请人:周红本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪血中提纯杀菌性／通透性增加蛋白的方法，其特征在于：首先将猪血中纯化的ＰＭＮＬ采用冷冻法制取ＢＰＩ粗提液；再以大肠杆菌作为结合菌进行孵育、离心得到结合菌体；然后从结合菌体中分离出蛋白质；最后进行透析，离心得纯化ＢＰＩ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周红，
申请(专利权)人：周红，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]