转化了表达质粒ｐ２２ｂＭＧ３或者其衍生物的大肠杆菌菌株。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。更具体地说，本专利技术涉及转化了表达质粒p22bMG3的大肠杆菌菌株以及利用该菌株重组生产雪花莲外源凝集素(Snowdrop lectin，Galanthus nivalis agglutinin，GNA)的方法。
技术介绍
植物外源凝集素是植物的防御蛋白，对植物有很重要的生理作用，已成为生物科学和医学研究中非常有价值的新工具，如分离和鉴定糖蛋白和糖脂，研究细胞和组织的组织化学新试剂，细胞分型，分离淋巴细胞和骨髓细胞，评估疾病患者的免疫状态，染色体分析等。雪花莲(Galanthus nivalis)外源凝集素(GNA)具有甘露糖特异结合活性。除了上述用途之外，对人类和动物的巨细胞病毒及逆转录病毒，具有强烈及选择性的抑制作用，正成为艾滋病研究的一个重要工具。另外，GNA对刺吸式和某些咀嚼式害虫、以及线虫均有毒性，在害虫和线虫病防治方面具有广阔的应用前景。目前GNA的制备方法主要是从雪花莲球茎中提取，因含量少、原料缺、分离方法繁琐，导致天然GNA的成本高、价格昂贵，仅美国Sigma公司有商品GNA出售，常常出现缺货。这严重制约了GNA的开发利用。雪花莲外源凝集素的基因已被克隆，其核苷酸序列及相应的氨基酸序列已被公开(参见van Damme，E.J.M.，Kaku，H.，Perini，F.，Goldstein，I.J.，Peeters，B.，Yagi，F.，Decock，B.and Peumans，W.1993.Biosynthesis，primary structure and molecular cloning ofsnowdrop(Galanthus nivalis L.)lectin.GenBank，1993，(Protein)，ACCESSION AAA33346.(Nucleotide)Locus GAAL2A accessionM55556.1)。然而，目前尚没有快速，简便，高效且经济地重组生产GNA的方法。本专利技术为满足现有技术中的这一需要提供了一种途径。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供可用于重组生产雪花莲外源凝集素(GNA)的大肠杆菌菌株。本专利技术的另一目的是提供重组生产雪花莲外源凝集素(GNA)的方法。附图说明图1是pC1300UG质粒的结构示意图。图2是重组质粒pMGT42的结构示意图。图3是大肠杆菌表达载体pET22b(+)的结构示意图。图4是重组表达质粒p22bMG3的结构示意图。图5是重组GNA多肽的完整氨基酸序列(SEQ ID NO1)及相应的编码核苷酸序列(SEQ ID NO2)。具体实施例方式本专利技术涉及转化了p22bMG3或者其衍生物的多种大肠杆菌菌株或者其衍生菌株，它们可以用来生产雪花莲外源凝集素。在本专利技术的上下文中，重组质粒的“衍生物”是指在质粒中外源基因的位置之外可以存在一些不影响该外源基因表达的额外序列，或者可以在雪花莲外源凝集素的编码序列中存在一些不改变所编码氨基酸的突变。普通技术人员知晓，不同的宿主生物存在比较偏爱的密码子用法。优选地，GNA编码基因针对待选用的宿主细胞而进行了密码子优化，以适于在其中表达。在一个实施方案中，所述额外序列可以是其他外源基因。在另一个实施方案中，所述额外序列可以是有助于本专利技术雪花莲外源凝集素纯化的标记序列，例如六组氨酸标记序列。在又一个实施方中，所述额外序列还可以是插入其中的接头序列，以便于例如其他基因的克隆。在本专利技术的上下文中，大肠杆菌宿主菌株的“衍生菌株”是指在宿主菌株的培养过程中形成的菌株，包括例如由其单克隆形成的菌株，或者在长期的传代培养过程中可能形成的因形态、外观或某些物理化学性质发生了改变、但与亲本菌株相比生产外源蛋白质例如雪花莲外源凝集素的能力未受到削弱的菌株，包括例如缺失了某些内源性蛋白酶基因的突变菌株。可用本专利技术中宿主菌株可以是本领域已知用于异源蛋白生产的任何大肠杆菌宿主菌株，包括市售的那些。在一个实施方案中，所述大肠杆菌宿主菌株是BL21(美国Novagen公司产品)。在另一个实施方案中，所述大肠杆菌宿主菌株是BL21的衍生菌株BL21(DE3)或B834(DE3)(美国Novagen公司产品)等。本专利技术包含了表达质粒p22bMG3或者其衍生物的重组大肠杆菌菌株可以用于基因工程化生产雪花莲外源凝集素。该生产方法包括如下步骤(1)在合适的营养培养基中在适于雪花莲外源凝集素表达的条件下培养本专利技术的上述重组大肠杆菌菌株；(2)从所得细胞培养物中回收所表达的重组雪花莲外源凝集素。在本专利技术方法中，利用本领域已知方法，在适于生产重组雪花莲外源凝集素的营养培养基中培养细胞。例如，可在实验室或工业用发酵罐内，在合适的培养基中、允许表达和/或分离该多肽的条件下经摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批补料或固相发酵)培养该细胞。培养是利用本领域已知方法(参见如Bennett J.W.和LaSure L.编，More Gene Manipulations in Fungi，学术出版社，CA，1991)，在含碳、氮源和无机盐的适宜营养培养基中进行的。适当的培养基可商购，或按照公开的组合物(如美国典型培养物保藏中心的目录中)配制而成，包括本领域中众所周知的那些，例如LB培养基，TB培养基，SOB培养基，NZCYM培养基，等等。本专利技术的重组菌株可以在任何合适的温度，例如18-37℃下培养，以表达雪花莲外源凝集素。优选地，可以在常温下，例如18-30℃，更优选地20-28℃，尤其是22-25℃温度下进行培养和发酵。在发酵过程中，可以向培养物中添加任何合适浓度的IPTG来进行诱导，例如IPTG终浓度为0.1-1.0mmol/L，优选地0.2-0.8mmol/L，更优选地0.2-0.5mmol/L。普通技术人员根据现有技术中的常规程序，即可很容易确定各种发酵工艺中的相应条件。发酵时间依具体情况而定，可以是几小时至数十小时。优选地2-10小时，更优选地5-8小时。发酵后，以常规蛋白质分离和纯化方法从培养物中回收所表达的蛋白质。已知的纯化方法包括从培养基中过滤分离细胞、采用超声波破碎法、冻融裂解法、溶菌酶法和高速珠磨法破碎重组大肠杆菌细胞、采用尿素或十二烷基肌氨酸钠等溶解包涵体，以及层析方法(如离子交换层析，亲和层析，疏水层析，层析聚焦，和大小排阻层析)，电泳方法(如制备性等电聚焦(IEF))，差异溶解性(如硫酸铵沉淀)，或者提取(参看，如《蛋白质纯化》，J.-C.Janson和Lars Ryden编著，VCHPublishers，纽约，1989)。下面参考实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1 重组表达质粒的创建参照“罗素兰等，GNA成熟蛋白基因的亚克隆及其大肠杆菌表达载体的构建。生物技术，2002(6)1-2”描述的操作构建重组表达质粒。具体地说，包括以下流程(1)GNA基因的克隆以pC1300UG(附图1，由复旦大学唐克轩教授赠送)为模板，用P4(5′GCCCATGGACAATATTTTGTACTCC 3′，SEQ ID NO3，下划线为添加的NcoI限制性酶切位点)和P2(5′TGGTCGACTCATCCAGTAGCCCAACGATC 3′，SEQ ID NO4下划线为添加的SalI限制性酶切位点)进行PC本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：罗素兰，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：
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