产生5′-黄苷酸的微生物制造技术

具有寡霉素抗性并产生５′－黄苷酸的产氨棒杆菌ＣＪＸＯＬ　　０２０１（保藏编号：ＫＣＣＭ　　１０４４７）。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种产生5′-黄苷酸的微生物。更具体地，本专利技术涉及一种产氨棒杆菌KCCM 10340的突变株，其对于抑制ATP合成酶活性和氧化磷酸化过程的寡霉素具有抗性，为了增强呼吸活性，使得在相同的发酵周期提高ATP的再生活性以及在高产率和高浓度比率下在培养基中积聚5′-黄苷酸成为可能。
技术介绍
5′-黄苷酸是一种在核酸生物合成过程中的中间产物，其在生理学上对于动物体和植物体是很重要的，可用于食品、医疗用品以及其他不同领域中。本专利技术涉及一种具有寡霉素抗性的突变株，该突变株是从已知的产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)KCCM 10340菌株而获得的，通过直接发酵法在高产率和高浓度比率下生产5′-黄苷酸。5′-黄苷酸是一种嘌呤核苷酸生物合成过程中的中间产物，并且是用于生产5′-鸟苷酸的重要原材料。一种广泛使用的用于生产精细而高质量的5′-鸟苷酸的方法是微生物发酵法，该方法首先生产5′-黄苷酸并将其酶转化成5′-鸟苷酸，因此，生产相应量的5′-黄苷酸对于生产5′-鸟苷酸是必需的。传统的生产5′-黄苷酸的方法是化学合成(化能合成)法将酵母菌中的核糖核酸分解，结果产生脱氨基的5′-鸟苷酸，包括以下几种方法在发酵培养基中加入黄嘌呤作为前体材料的发酵方法；利用微生物突变株的发酵方法；加入抗生素材料的方法(JP 1477/42和JP 20390/44)；以及加入表面活性剂的方法(JP 3825/42和JP 3838/42)等等。在这些方法中，通过微生物突变株的5′-黄苷酸的直接发酵法在产业化方面有着相当大的优势。因此，本申请专利技术人通过使产氨棒杆菌KCCM 10340现有的特性改变(modifying)为以高产率产生5′-黄苷酸的特性而得到了一种具有提高的5′-黄苷酸生产率的突变株。大部分微生物达到一定条件，当在恒定的条件下培养时其体积不再增加，尤其是，微生物产生的初级代谢产物(即生长依靠型产物)的浓度不会再增加。这主要是由于有限的溶解氧供应而引起的。为了除去有限的溶解氧供应，可以使用增强通风条件和搅拌条件的方法，但是在实际生产中还存在技术上和经济上的制约。为了在有限的溶解氧供应条件下，通过提高微生物的体积和各种生理活性来克服此局限性并提高5′-黄苷酸的产率和浓度，本专利技术专利技术人认为在同样的溶解氧条件下，提高微生物的呼吸活性和ATP再生活性的方法是有效的。因此，专利技术人研究了对各种呼吸抑制剂具有抗性的微生物菌株，并且发现对寡霉素具有抗性的突变株在这些微生物菌株中是最有效的，其可以在高产率和高浓度比率条件下通过直接发酵法来生产5′-黄苷酸，并且在本专利技术中实现了该目的。
技术实现思路
本专利技术涉及产氨棒杆菌CJXOL 0201(KCCM-10447)，其是产生5′-黄苷酸的产氨棒杆菌KCCM 103040的一种突变株。CJXOL0201是根据普通程序，通过利用紫外射线和突变诱变剂如N-甲基-N′-硝基-正-亚硝基胍(NTG)处理产氨棒杆菌KCCM 10340，并且从这些能够在加入不同浓度水平的寡霉素(1，2，5，10，20，50mg/L)的培养基(葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，尿素2g/L，硫酸铵3g/L，硫酸镁1g/L，氯化钙100mg/L，硫酸亚铁20mg/L，硫酸锰10mg/L，硫酸锌10mg/L，生物素30μg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，硫酸铜0.8mg/L，腺嘌呤20mg/L，鸟嘌呤20mg/L，pH7.2)中生长的菌株中选择而获得的一种突变株。在该程序中，将0～50mg/L的寡霉素加入到培养基中，并且显示出高达20mg/L的寡霉素抗性，但是当浓度水平高于20mg/L时，则没有观察到任何生长。将能够在20mg/L寡霉素中生长的菌株分离出来，并命名为CJXOL 0201，于2002年11月21日将其保藏在布达佩斯条约下的韩国微生物培养中心，保藏编号为KCCM 10447。本专利技术的新颖的突变株CJXOL 0201的生物化学特性如以下的表1所示。根据表1，本专利技术的微生物能够在加入了10mg/L的寡霉素的培养基中生长。该培养基在30℃下发酵5天。表1 +生长；-不生长具体实施方式实施例1所使用的菌株产氨棒杆菌KCCM 10340，产氨棒杆菌CJXOL0201接种培养基葡萄糖30g/L，蛋白胨15g/L，酵母提取物15g/L，氯化钠2.5g/L，尿素3g/L，腺嘌呤150mg/L，鸟嘌呤150mg/L，pH7.2 发酵培养基(1)A培养基葡萄糖60g/L，硫酸镁10g/L，硫酸亚铁20mg/L，硫酸锌10mg/L，硫酸锰10mg/L，腺嘌呤30mg/L，鸟嘌呤30mg/L，生物素100ug/L，硫酸铜1mg/L，盐酸硫胺素5mg/L，氯化钙10mg/L，pH7.2(2)B培养基磷酸二氢钾10g/L，磷酸氢二钾10g/L，尿素7g/L，硫酸铵5g/L发酵方法将5mL的接种培养基倒入直径为18mm的试管，并且根据常见方法在压力下灭菌。灭菌之后，分别将产氨棒杆菌KCCM 10340和产氨棒杆菌CJXOL 0201接种，并且在180rpm、30℃下摇床培养18小时。将该产物用作种子培养物。然后，作为发酵培养基，将A培养基和B培养基按照常规方法分别在压力下灭菌，将29mL的A培养基和10mL的B培养基分别倒入用于摇动的已灭菌的500毫升(mL)锥形烧瓶中，并且将1mL的上述种子培养物接种到培养基中，在200rpm、30℃下发酵90小时。在发酵完成之后，显示在KCCM 10340中的5′-黄苷酸的积聚量为23.0g/L，而在CJXOL 0201中的5′-黄苷酸的积聚量为26.5g/L。(5′-黄苷酸的积聚浓度是以5′-黄苷酸钠·7H2O给出的)。实施例2所使用的菌株与实施例1相同一次种子培养基与实施例1的种子培养基相同二次种子培养基葡萄糖60g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁1g/L，硫酸亚铁22mg/L，硫酸锌15mg/L，硫酸锰10mg/L，硫酸铜1mg/L，氯化钙100mg/L，生物素150μg/L，腺嘌呤150mg/L，鸟嘌呤150mg/L，盐酸硫胺素5mg/L，消泡剂0.6mL/L，pH7.2 发酵培养基葡萄糖151g/L，磷酸32g/L，氢氧化钾25g/L，腺嘌呤198mg/L，鸟嘌呤119mg/L，硫酸亚铁60mg/L，硫酸锌42mg/L，硫酸锰15mg/L，硫酸铜2.4mg/L，丙氨酸盐22mg/L，NCA7.5mg/L，生物素0.4mg/L，硫酸镁15g/l，胱氨酸盐30mg/L，组氨酸盐30mg/L，氯化钙149mg/L，盐酸硫胺素15mg/L，消泡剂0.7mL/L，CSL 27mL/L，金枪鱼提取物6g/L，pH7.3一次接种培养将50mL的一次种子培养基倒入500mL用于摇动的锥形瓶中，并且在121℃、压力下灭菌20分钟。冷却以后，将产氨棒杆菌KCCM 10340和产氨棒杆菌CJXOL 0201分别进行接种，并且在180rpm、30℃下摇床培养24小时。二次接种培养将二次种子培养基倒入5L的试验发酵浴中(每个为2L)，在121℃、加压下灭菌10分钟。冷却以后，将50mL的上述一次种子培养基接种，并且在供本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭荣贤，吴奇勋，金祯焕，吴润锡，沈载益，朴英薰，张裁永，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：