细菌和用所述细菌生产化合物的方法技术

本发明专利技术涉及棒杆菌细菌，所述细菌除在其天然位点（座位）具有至少一个拷贝的编码蛋白质或ＲＮＡ合成的可读框（ＯＲＦ）、基因或等位基因外，一定还在第二个、可选地在第三个或第四个位点以整合入染色体的形式具有第二个、可选地第三个或第四个拷贝的该可读框（ＯＲＦ）、基因或等位基因；本发明专利技术还涉及用所述细菌发酵制备化合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】现有技术化合物，特别是指L-氨基酸、维生素、核苷和核苷酸以及D-氨基酸，被用于人类药物、药品工业、化妆品、食品工业和动物营养物中。诸多的此类化合物是通过发酵棒杆菌菌株，尤其是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)来制备的。由于这些物质非常重要，因此不断地努力改进这些制备方法。对此方法的改进可以涉及发酵措施，例如搅拌和氧气的供给，或营养培养基的组成例如发酵过程中的糖浓度，或通过例如离子交换层析逐渐形成产物形式，或者微生物自身的固有输出特性。利用了诱变、选择和突变体选择方法来改进这些微生物的输出特性。用这种方式获得了能产生特定化合物的，对于抗代谢物有抗性的菌株，或者是对于在调控上重要的代谢物为营养缺陷型的菌株。多年来还利用了重组DNA技术方法，通过扩增单个生物合成基因和调查生产效果，来改进棒杆菌(Corynebacterium)菌株。一种常用方法包括通过附加型复制质粒在特定微生物中扩增某些生物合成基因。该方法有一个缺点是，质粒在发酵过程(在工业方法中发酵通常涉及许多代)中自然丢失(分离不稳定性)。另一种方法包括借助不在特定微生物中复制的质粒来复制特定的生物合成基因。在这一方法中，包括了克隆的生物合成基因的质粒被整合进该微生物的染色体生物合成基因(Reinscheid等人，Appliedand Environmental Microbiology 60(1)，126-132(1994)；Jetten等人，Applied Microbiology and Biotechnology 43(1)76-82(1995))。该方法的一个缺点是，质粒的核苷酸序列以及选择所必需的抗生素抗性基因的核苷酸序列保留在微生物中。这对于例如生物质的处理和利用是不利的。此外，专家预计，由于在相应世代数(比如工业发酵中常用的)中通过“坎贝尔型交换(Campbell type crossover)”而去整合，这样的菌株是不稳定的。专利技术目的本专利技术人的目的是，为利用棒杆菌细菌发酵制备化合物提供新的改进措施。专利技术概述本专利技术提供生产化合物的棒杆菌细菌，它除了在天然位点(座位)含有一个拷贝的一或多个编码合成用于所述化合物合成的蛋白质或RNA的可读框(ORF)、基因或等位基因外，还在一或多个附加的位点处，优选在第二个、以及可选地在第三或第四个位点处以整合入染色体的形式含有一个或多个，尤其是第二个、可选地第三或第四个拷贝的所述可读框(ORF)、基因或等位基因，其中至少一个所述位点选自基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件或者编码所述原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的DNA。在第二个、可选地在第三个或第四个位点不存在于微生物中能够/使得能够进行附加型复制或转座的核苷酸序列，和不存在赋予其抗生素抗性的核苷酸序列，第二个、可选地第三个或第四个位点不涉及对于细菌的生长和所需化合物的产生必需的可读框(ORF)、基因或等位基因。本专利技术还提供制备一种或多种化合物的方法，其中采取以下步骤a)发酵棒杆菌细菌，该棒杆菌细菌除了在天然位点(座位)存在一或多个编码用于合成所述化合物的蛋白质或RNA的可读框(ORF)、基因或等位基因外，b)还在某些位点将一或多个，尤其是第二个、可选地第三或第四个拷贝的所述可读框(ORF)、基因或等位基因整合进染色体，由此c)至少一个所述位点选自基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件或者编码所述原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的DNA，d)在所述位点不存在于微生物中能够/使得能够进行附加型复制或转座的核苷酸序列，和不存在赋予其抗生素抗性的核苷酸序列，e)在所述可读框(ORF)、基因或等位基因能够表达的条件下进行过表达，浓缩发酵液体培养基和/或细菌细胞中的化合物，f)分离该化合物，可选地g)连同来自发酵液体培养基和/或生物质中的成分一起，直至＞(大于)0至100wt％。相应蛋白质的细胞内活性或浓度与起始细菌(亲本细菌或野生型)中的活性或浓度相比得到提高，尤其是编码所述蛋白质的核苷酸序列过表达时。一般这一提高至少为10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，最大为1000％或2000％。本专利技术还提供这样的棒杆菌细胞，即其含有与存在于天然位点并编码用于合成所述化合物(尤其是氨基酸)的蛋白质或RNA的可读框(ORF)、基因或等位基因优选以串联排列(tandem arrangement)直接相邻的第三或第四个拷贝的所述可读框(ORF)、基因或等位基因，如WO 03/014330中所述。“串联排列”意为，两或多个ORF、基因或等位基因纵列彼此直接相邻且方向相同的排列方式。两或多个直接相邻的ORF、基因或等位基因的另一种方向类型可以称作反向。这些棒杆菌细菌另外对于在选自基因间区域、原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的位点处的拷贝包括所述的“串联排列”。本专利技术还提供所述的发酵所述棒杆菌细菌的方法。专利技术详述化合物尤其是指氨基酸、维生素、核苷和核苷酸。这些化合物的生物合成途径在现有技术中是已知且可利用的。氨基酸优选意指L-氨基酸，特别是蛋白质源的L-氨基酸，选自L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-谷胺酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸和L-精氨酸及其盐，尤其是L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和L-苏氨酸。L-赖氨酸是极为优选的。蛋白质源的氨基酸意指出现在天然蛋白质中的氨基酸，也就是说出现在微生物、植物、动物和人的蛋白质中。维生素意指，尤其是维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆醇)、维生素B12(氰钴胺素)、烟酸/烟酰胺、维生素M(叶酸)和维生素E(生育酚)及其盐，泛酸为优选的。核苷和核苷酸意指，除其它之外，S-腺苷-甲硫氨酸、肌苷-5′-单磷酸和鸟苷-5′-单磷酸及其盐。棒杆菌细菌特别是棒杆菌属(Corynebacterium)的细菌。在棒杆菌属中，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)和Corynebacteriumthermoaminogenes为优选。除其它之外，可以在K_mpfer和Kroppenstedt(Canadian Journal of Microbiology 42，989-1005(1996))以及在US-A-5,250,434中找到该组细菌中菌株的分类学信息。棒杆菌属的适宜菌株(尤其)是已知的野生型菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)ATCC15990Corynebacterium melassecola ATCC17965力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)ATCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
棒杆菌细菌，它除了在天然位点（座位）含有一个拷贝的一或多个编码用于合成化合物的蛋白质或ＲＮＡ的可读框（ＯＲＦ）、基因或等位基因外，ａ）还在整合进染色体的位点处含有一或多个拷贝的所述可读框（ＯＲＦ）、基因或等位基因，由此ｂ）不 含有在微生物中能够／使得能够发生复制或转座的核苷酸序列，和ｃ）在所述位点不含有赋予抗生素抗性的核苷酸，和ｄ）所述位点与对所述细菌的生长以及目的化合物的生产而言至关重要的可读框（ＯＲＦ）、基因或等位基因无关，ｅ）至少一 个所述位点选自基因间区域、原噬菌体和缺陷噬菌体或噬菌体组件或者编码所述原噬菌体、缺陷噬菌体或噬菌体组件的ＤＮＡ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：B巴特，C赖嫩，B黑德里希，G蒂尔巴赫，
申请(专利权)人：底古萨股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]