一株丙酮丁醇梭菌及其筛选方法和用途技术

本发明专利技术涉及生物发酵技术领域，具体涉及一株能快速利用淀粉发酵生产生物丁醇的丙酮丁醇梭菌及其筛选方法和用途。本发明专利技术公开了一种丙酮丁醇梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）菌株ＲＡＢ３２２６，属于丙酮丁醇梭菌ＣＩＣＣ８０１１的突变株，保藏号为ＣＴＣＣ　Ｍ２０７１９９。本发明专利技术通过ＮＴＧ诱变，淀粉透明圈和丁醇结构类似物双平板筛选，得到的菌株能够快速利用淀粉发酵生产生物丁醇，丁醇比高，解决了传统工艺上以玉米粉为原料废醪ＣＯＤ高的问题，对环境更友好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物发酵
，具体涉及一株通过诱变选育得到的丙酮 丁醇梭菌，以及该丙酮丁醇梭菌的筛选方法和该丙酮丁醇梭菌在快速利用淀 粉发酵生产生物丁醇中的应用。
技术介绍
丁醇是重要的化工材料单体。丁醇广泛用于各种塑料和橡胶制品的生产。我国丁醇供需矛盾十分突出，进口量占消费量的50%以上。丁醇作为替代汽 油的生物燃料也得到国际上很大的重视。与乙醇相比，丁醇能与汽油以更高 的比例混和，更适合在现有的燃料供应和分销系统中使用；生物丁醇的经济 性更高，能提高车辆的燃油效率和行驶里程。与石油燃料相比，生物丁醇产 生是以可再生资源为原料，而且具有显著的环境效益。丁醇的生产方法有生物法和化学法。化学法生产丁醇的原材料为石化下 游产品丙烯，预计到2010年，中国对丙烯的当量需求将达到1905万吨，供 需缺口将达到825万吨。而石油的价格飞涨和资源加速枯竭正在将已经成为 世界上第二大石油进口国的中国推向石油经济时代的悬崖边！开发发酵法生 产丁醇新技术除其直接经济效益外还可以为开发新的可再生资源提供一条新 途径。近年来，国内对丙酮丁醇发酵的研究很多，主要围绕着菌种诱变、发酵 工艺条件优化、溶剂提取等方面进行研究。1995年颜叙秀报道利用紫外诱变 丙酮丁醇梭菌提高代谢产物；1999年马光庭等进行了对糖蜜发酵生产丙酮丁 醇菌种筛选及对小试发酵条件的选择进行了研究；ZL专利号95111733.5报 道了焦瑞身等对高丁醇比丙酮丁醇梭菌进行选育，他们通过化学试剂诱变， 利用玉米粉或者高粱，得到总溶剂在20g/L左右，丁醇产量为总溶剂的70%; 2001年，县永平对丙酮丁醇梭菌固定化技术进行了研究；1998年，陈守 文等研究了稻草酶法水解液的丙酮丁醇发酵，研究将纤维资源用于丙酮丁醇 发酵。国外近年来主要围绕着利用基因工程和采用新发酵工艺来提高菌株的 代谢性能和生产效率；比较有代表性的是美国Illinois大学所做的工作。他 们用膜渗透汽化与发酵耦联进行ABE发酵的研究、利用gas-stripping和发 酵耦联工艺进行ABE发酵的研究。2005年，美国专利US2005/0089979A1报 道了利用gas-stripping和连续发酵耦联来生产丙酮丁醇，这些实验一般在 1L罐的水平上，而且采用的原料多为葡萄糖，并且丁醇比停留在60-70%之间。 同时传统意义上的丙酮丁醇生产以玉米粉为原料进行发酵，造成发酵废醪的 C0D高，对环境造成了不良影响。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题之一在于开发具有新的性能的丙酮丁醇菌 株，它能够快速利用淀粉，溶剂量高，发酵废醪的C0D低。本专利技术所要解决的技术问题之二在于提供所述丙酮丁醇菌株的筛选方法。本专利技术所要解决的技术问题之三在于提供所述丙酮丁醇菌株的用途。作为本专利技术第一方面的丙酮丁醇菌株，其特征在于它是丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)菌株RAB3226，属于丙酮丁醇梭菌CICC 8011 的突变株，保藏号为CCTCCN0: M207199，保藏日期2007. 12.14，保藏单位 中国典型培养物保藏中心，中国、武汉、武汉大学。作为本专利技术第二方面的丙酮丁醇菌株的筛选方法，是以丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)为出发菌株，采取了化学诱变，并利用淀粉平 板和丁醇结构类似物平板，进行双平板筛选，得到一株能够利用淀粉快速发 酵生产生物丁醇的丙酮丁醇梭菌。在一实施方案里，本专利技术所述的丙酮丁醇梭菌为中国工业微生物菌种保 藏中心编号CICC 8011的丙酮丁醇梭菌株。在一实施方式里，本专利技术所述的筛选方法的具体筛选步骤如下a) 初筛菌种保藏的丙酮丁醇菌活化培养，得到生长旺盛、菌形粗壮的 菌液；吸取菌液经淀粉平板初筛，挑选出透明圈大和出现时间早的菌株；单 菌落接入种子培养基扩大培养，然后在发酵培养基中发酵，筛出总溶剂量高 的菌落；b) NTG诱变亚硝基胍诱变剂(NTG浓度10-50ug/ml)处理初筛的菌 种，10画20min;c) 淀粉平板筛选吸取NTG处理的菌液经淀粉平板筛选，挑选透明圈 大和出现时间早的菌株；d) 高丁醇比菌种的筛选淀粉平板筛选出的单菌点植于2-丁醇平板，挑 选生长旺盛的菌落；e) 试管发酵筛选将步骤d)筛出的菌落接入种子培养基扩大培养，然后 在发酵培养基中试管发酵，挑选满足溶剂量18-23g/L， 丁醇比68-80%的两个 条件的菌株。f) 稳定性试验将步骤e)筛出的菌落接入发酵培养基中连续传代32次， 传代温度35-40°C;经过32次传代，挑选发酵指标满足18-23g/L， 丁醇比 68-80%的两个条件的菌株作为目的菌株。在上述筛选方法中，步骤a)和c)中所述淀粉平板采用下列重量比的原 料和步骤制备出葡萄糖0-2%，糊化淀粉1-6%,牛肉膏0.1-2%，蛋白胨 0.01-0.1%，磷酸二氢钾0-0.1%，氯化钠0-0.1%，硫酸亚铁0-0.05%，硫酸钙 0-0.5%,琼脂2%，用5M的NaOH调节pH5.5-6.0，原料加热溶解于水，灭菌， 制备平板；配置0.01-0.5%的碘溶液，滤膜除菌，在平板上均匀涂布碘溶液， 使整个平板培养基呈兰色。步骤b)中所述NTG浓度优选40ug/ml。步骤d)中所述2-丁醇平板采用下列重量比的原料和步骤制备出葡萄 糖0-2%，糊化淀粉1-6%,牛肉膏0.1-2%，蛋白胨0.01-0.1%，磷酸二氢钾 0-0.1%,氯化钠0-0.1%，硫酸亚铁0-0.05°/。，硫酸钙0-0.5%，琼脂2%， pH5.5-6.0; 原料加热溶解于水，灭菌，培养基尚处于融化态加入无菌的2-丁醇，2-丁醇 在培养基中的浓度为1.0-2.5%,混匀后制备平板。 所述种子培养基采用下列重量比的原料制备出葡萄糖3-7%,牛肉膏0.1-2%，蛋白胨0.01-0.1%,磷酸二氢钾0-0.1%，氯化钠0-0.1%，硫酸亚铁 0-0.05%，硫酸l丐0-0.5%， pH5.5-6.0。所述发酵培养基采用下列重量比的原料和步骤制备出糊化淀粉5-8%， 牛肉膏0.1-2%,蛋白胨0.01-0.1%，磷酸二氢钾0-0.1%，氯化钠0-0.1%,硫 酸亚铁0-0.05%，硫酸f丐0-0.5%， pH5.5-6.0。作为本专利技术第三方面的丙酮丁醇菌株的用途，其主要是在生产丁醇中的应用。本专利技术通过NTG诱变、淀粉透明圈和丁醇结构类似物双平板筛选，开发 具有新的性能的丙酮丁醇生产菌株，它能够快速利用淀粉，溶齐jj量高，丁醇 比高，发酵废醪的COD低，解决了传统工艺上以玉米粉为原料废醪COD高 的问题，对环境更友好。附图说明图1为本专利技术丙酮丁醇菌株的筛选方法的流程图。具体实施例方式本专利技术对部分术语定义如下"种子培养基"是供微生物发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长 得粗壮，成为活力强的"种子"。所以种子培养基的营养成分要求比较丰富 和完全，氮源和维生素的含量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这样可达 到较高的溶解氧，供大量菌体生长繁殖。种子培养基的成分要考虑在微生物 代谢过程中能维持稳定的pH，其组成还要根据不同菌种的生理特征而定。 一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺 激孢子发芽。但本文档来自技高网...

【技术保护点】
丙酮丁醇菌株，其特征在于它是丙酮丁醇梭菌菌株ＲＡＢ３２２６，保藏号为ＣＴＣＣ　Ｍ２０７１９９。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李乃强，廖锦绣，俞宏峰，
申请(专利权)人：上海凯赛生物技术研发中心有限公司，上海凯赛生物科技有限公司，凯赛生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]