黄尾鰤腹水病毒的快速检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开一种黄尾鰤腹水病毒的快速检测试剂盒及其检测方法。本发明专利技术包括由Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶、逆转录酶、反应缓冲液、环介导等温扩增混合液、引物混合液和荧光显色剂共６种试剂组成的试剂盒，以及使用该试剂盒检测鱼类样品中黄尾鰤腹水病毒的一套检测操作程序，以实现对黄尾鰤腹水病毒快速检测的标准化，为鱼类的健康养殖和国际鱼类贸易的发展提供科学依据。本发明专利技术具有特异性好、灵敏度高、操作简便、高效等优点，可广泛的应用于水产养殖场以及进出口鱼类贸易中的现场即时检测，并可以为相关基础研究提供技术支持，具有广泛应用前景。

【技术实现步骤摘要】
黄鄉f駄病毒的鹏检测淑戯微测方法狱领域本专利技术属于水产动物病原的检测技术，具体是一种OT环介导^^"增fe^对fi^M，il^病毒 进行鹏检测的湖紐微测方法。 背景駄黄尾蛳腹水病毒隶属于双片段RNA病毒科(Bimaviridae)、水生双片段RNA病毒属 (Aquabimavirus)，于1985年首 ^A黄尾鲫(Seriolaquinqueradiala)分离至IJ。彌毒可以感染舻鱼、真鲷、 日本比目鱼、琥珀鱼、黄ilffi瞎:fe^，目前也B^A贝——日^^贝中分离至横難師膨Jc病毒。黄尾 鰣膨Jc病毒F驟响海水舗鱼类的一种传染鹏病的病原，对亚洲海洋水产辭1 ^了严重的危 害。鉴于其严重的危害性，中国国家质M督检验m&局与韩国海洋水产部于2005年发布的忡韩进 出口活7jC生动t)^验^S协议》中规定，中国出口到韩国的舻鱼、真鲷、大 、 ，m^^S行黄MW膨K病毒的检验^S，以防止黄鄉f膨乂病謝专播SM，给本国的水产# 1 失。因此， 迫切需要5fei',、灵敏、M的黄mW膨Jc病毒的检测方法，^m国夕Ki术S^，为国家贸易服务。 目前 ^毒的检测方法主要包鄉胞学鄉技术、被学诊断技术、肝生物学诊断技术三大类。 细胞学诊断技术主要包括翻细胞*§#分离病毒、组织滴理切片及电傲见察，其操f^5员，检测周期长， 且灵鹏氏；被学诊断技术主要包括免疫荧光检测、嫉点杂交，其方法具有特异性强、,性高的 优点，但方法相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测；W生物学诊断技术主要包括聚合WI式反应 (PCR)，比较'^il、灵敏，但是需要昂贵的PCR仪器，另外需要琼月^| 电泳，溴化乙锭lfefea察 结果，溴化乙锭^g0S,，对人体和环境有危害，XX污染问题比gP重。环介导^f显扩增(LoopMedialedlso1hemialAmplification,简称LAMP) ，是一种 性高、特 异注强的耙DNA'K3I检测方法'不需要昂贵的仪器，样品中含有少量的病原就能检出。环介导^^扩增目前己Mra^于检湖i冰生繊的病原体，如鱼魏毒(鲤春血症病毒、传染iiwy^毒、传染^itifii器官^E病毒、锦鱼醜疹病毒)、)^補毒(X她下白斑^^症病毒、黄彌毒)、细菌(迟钝爱德华氏菌)等。据櫞，目前尚未i^环介导等显扩imfc^j^鄉ii7K病毒进行'i^i检测附隨。
技术实现思路
本专利技术的目的^f共一种和用环介导^r增技^^测黄，f0^病毒的检测K^盒，劍野见有技术的不足，以满足5贴l;即B^i啲要求。本专利技术的另一目的^(共这#^测试剂盒的检测方法，以方便拟]^^1^和国际，贸易中 尾龟鹏脉病毒进行鹏检测中的卿。本专利技术的主要原理为LAMP ^:對吏核WiS，环境中的循环置^r增实l!^lE^列的放 大，从而超啦测的目的。翻Mimtt"对革隨因的6个区域，设计2 5 辨寺异性引物，同时可以设计l-2 条环引物以加快反应速度，利用一种链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bacillus stearo1heimophilus DNA polymerase,简称BstDNA ^^ )， ^S'度温65。C^^Sl3^勺lh。 BstDNA^^t两;Wf性 一是具有5'-3衆雜活性，能在恒温状态下扩增DNA核酷二是BstDNA聚彌具有驢换话性，倉鹏新合 成的核酸单^A人新^的dna双^hS爽取代)下来，形成两条3拉的核酸单链以开启下一轮的dna 核齡成，进而免去了每 银增前的DNA ^fe环节。LAMP^IS31程中，一X寸弓嫩的5' ^"有一段 与下S衬广增f^勿互补的序列，因此，舰引物的单^ 可形成一个类似鹏令状的回文结构，这种结 构lB子为下一^^驢對广增反^i共了一个可鹏而穀解鹏附難，BstDNA聚^H^ffi髓换活 性，后阶腿火的引物置换前面引物所形成的链，从而保证了扩增的i^卖进行。LAMP反娜成一系列 不同，的具有茎环结构的dna产物，可以fflil荧光染料进行检测。 本专利技术的技术方案如下-黄鄉師膨JC病毒的环介导等尉广增I^S樹则i凝i傖'包括lli乓M^须的BstDNA聚娜、逆緑 酶、S/^l冲液、环介导^a扩增混合液、引微昆合液和荧5fcM色剂，以^il^一种《顿该i凝!j^^测 fi^f品中黄尾獅膨JC病毒的方法，以实嫩!m鄉f膨K病毒KiS检测的标准化，为fi^M離f膨K病 ft的检测樹共一种'腿、简便、高效、实用的检测方法。本专利技术的黄尾敏f膨K病毒的环介导^T增I^I检测淑iJ盒的配加口下淑!JA: BstDNA聚^H (8U4tL);湖B:逆$^@| (200U4iL);试剂C:反磁爰冲液，樹共BstDNA聚^SIfPJl^SI辦作用所必领的物质，其中含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、 100 mmol/L氯化钾(KC1)、 100 mmol/L硫酸铵 ((NH4)zS04)、 80mmol/L硫,(MgS04)和lX曲f娜X-100 (TritonX隱100);i微ijD:环介导等显扩增混合液，其中含有4.0nL2.5mmol/LdNTP、 2.0ML10mol/L甜娜、0.5^L 200U/pLRNA謝輔跻诉口5"6MLOT生物学M^7jC;试剂e:引物混合液，其中含有2ijL20Mmol/L正向内弓物、2ML20pmol/L反向内弓嫩、1 nL5pmol/L 正向外引物、lnL5Mmol/L反向外引物和lML20pmol/L反向环引物；其中引物序列分别如下 正向内弓卿5'- CGCCATGGGGAAGAGTGTTGATnTCAITGTGAGAGGCArCCGG -3'; 反向内弓嫩5'-AGCCGCCGACCAATTCATCGTnTGTCCTCCTGCTGCATGTG-3'; 正向外弓嫩5'- TCCCAACCTCTCAAGCCT-3'; 反向外引物5'-CTGGCCCAGGAGTCCA3T-3'; 反向环弓l物5'- agacctgaccaagaccaacg-3'。i叙UF:荧jtM色剂，成分为100x的荧光染料SYBR GREEN I 。細黄嵐師驗病毒的环介导離扩增'腿检测鄉盒的樹则施如下(1) 待^lt样品的rna的Ji取 用商业化的试剂盒或者传统的方^^取待检样品的RNA，用核酸分析仪测定RNA，保证其OEWOD2so在1.7-2.0范围内，调 ^度在100-200ng/pL之间。(2) 进摘尾鲫膨爐毒的环介导離扩增鹏首先取4 0.2 mL的聚丙烯塑料管，力口入1-2的步骤(1)提取的待测样品的RNA，再加入1 试剂a， 1mL拭剤B， 2.5ML试剂c, 11.5-12.5hL微UD， 8nL试剂e，使得鹏g、^f只为25pL。其中引物序列分别如下正向内引物5'- CGCCATGGGGAAGAGTGTTGATnTCAITGTGAGAGGCATCCGG -3'; 反向内弓嫩5'-AGCCGCCGACCAATTCATCGTnTGTCCTCCTGCTGCATGTG-3'; 正向外弓l物5'- TCCCAACCTCTCAAGCCT -3'; 反向外引物5'-CTGGCCCAGGAGTCCATT-3'; 反向环弓胸5'- AGACCTGACCAAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄尾鰤腹水病毒的快速检测试剂盒，其特征在于试剂盒中包括试剂Ａ－Ｆ：　试剂Ａ：ＢｓｔＤＮＡ聚合酶，８Ｕ／μＬ；　试剂Ｂ：逆转录酶，２００Ｕ／μＬ；　试剂Ｃ：反应缓冲液，其中含有２００ｍｍｏｌ／ＬｐＨ８．８的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、１００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾、１００ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸铵、８０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸镁和１％曲拉通Ｘ－１００；　试剂Ｄ：环介导等温扩增混合液，其中含有４．０μＬ　２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ、２．０μＬ　１０ｍｏｌ／Ｌ甜菜碱、０．５μＬ２００Ｕ／μＬ　ＲＮＡ酶抑制剂和５－６μＬ分子生物学级超纯水；　试剂Ｅ：引物混合液，其中含有２μＬ２０μｍｏｌ／Ｌ正向内引物、２μＬ２０μｍｏｌ／Ｌ反向内引物、１μＬ５μｍｏｌ／Ｌ正向外引物、１μＬ　５μｍｏｌ／Ｌ反向外引物和１μＬ２０μｍｏｌ／Ｌ反向环引物；其中引物序列分别如下：　正向内引物：５′－ＣＧＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＴＧＡＴＴＴＴＣＡＴＴＧＴＧＡＧＡＧＧＣＡＴＣＣＧＧ－３′；　反向内引物：５′－ＡＧＣＣＧＣＣＧＡＣＣＡＡＴＴＣＡＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧ－３′；　正向外引物：５′－ＴＣＣＣＡＡＣＣＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴ－３′；　反向外引物：５′－ＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＡＴＴ－３′；　反向环引物：５′－ＡＧＡＣＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＧ－３′。　试剂Ｆ：荧光显色剂，成分为１００×的荧光染料ＳＹＢＲＧＲＥＥＮＩ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：岳志芹，刘荭，史秀杰，贾俊涛，梁成珠，李琼，凌宗帅，郑小龙，邓明俊，肖西志，赵巍，孙涛，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]