一种用于检测番茄不孕病毒的方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种检测番茄不孕病毒（ＴＡＶ）的方法，该方法利用环介导等温扩增反应（ＬＡＭＰ）检测番茄不孕病毒（ＴＡＶ）；该方法包括的步骤依次为：配制反应体系、温育处理、灭活处理、产物检测；所述的反应体系中包括：Ｂｅｔａｉｎｅ：０．５－１．５ｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰ：２－２５ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｍｇ↑［２＋］：２－１５ｍｍｏｌ／Ｌ，外引物，内引物；所述的内引物和外引物的浓度之比为１∶１－１∶８。本发明专利技术的有益效果为：不需要特殊仪器（如ＰＣＲ仪），较实验室常规律方法更快捷，经济；鉴定简便，有极高的特异性，只要用肉眼观察或浊度仪紫外成像系统检测沉淀浊度就能够判断目的片段扩增与否，从而判断出用于检测的样品植株是否感染有番茄不孕病毒，而不必用凝胶电泳的方法来观察。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物病毒的检测领域，特别涉及一种检测番茄不孕病毒的 方法，该方法利用环介导等温扩增反应(LAMP)检测番茄不孕病毒。
技术介绍
菊花是中国传统名花，也是世界四大切花之一,但由于病毒病的危害,使 菊花品质、产量下降,品种退化十分严重。危害菊花的病毒种类很多，已报 道的有20余种。番茄不孕病毒(tomato aspermy virus, TAV)是危害菊花 的一种的重要病原，在观赏性菊花上普遍发生。番茄不孕病毒归属为黄瓜 花叶病毒属，患病菊花病时出现花叶、扭曲，植株萎縮，花色不正常。汁 液、桃蚜和其他一些蚜虫作非持久性传播。少数能种传。带毒杆头也能传 播病毒。花卉病毒病是由病毒引起的危害花卉植物的一类特殊病害，该病 在症状特点、发生规律及防治措施等方面与一般病害差异较大。随着国内 外花卉贸易的发展，种苗的流通和种苗的自繁，病毒病问题也变得非常突 出，近年来已上升到公次于真菌性病害的地位，它影响了花丼的产量和品 质，也影响了花卉的出口创汇。以及国外引种时海关检疫、茎尖脱毒检测 等要求在组织病毒含量极低时及早检测。因此，发展快速准确、操作简便 的检测与鉴定病毒的方法一直是相关研究的热点。因此，发展的检测与鉴 定病毒的方法一直是相关研究的热点。目前，普遍采用的聚合酶链式反应(PCR)检测方法需要专门的仪器，检测成本高，而且存在易交叉污染、 操作繁琐的缺点，且不利于现场的快速检测，推广应用难度较大。所以， 科学研究和生产实践中均需要一种快速准确、操作简便的番茄不孕病毒的 检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测番茄不孕病毒的方法，该方法利用环介 导等温扩增反应(LAMP)检测番茄不孕病毒(TAV)。 该方法包括的步骤依次为A. 配制反应体系；B. 将所述的反应体系进行温育处理，得到温育产物；该温育处理的温度为65。C，时间为30-80min;C. 将所述的温育产物进行灭活处理，得到灭活产物；该灭活处理的 温度为80°C ，时间为5-15min;D. 将所述的灭活产物进行检测，得到检测结果。所述的反应体系中包括 B etaine0 5 -1.5 mol/L ， dNTP2-25mmol/L， Mg2+2-15mmol/L ，外引物，内引物；所述的内引物和外引物的浓度之比为1: l一l: 8;上述反应体系中，根据GenBank公布的番茄不孕病毒中的保守序列设 计的特异性的LAMP引物，该保守序列为TAV外壳蛋白(Genbank登陆 号EU499736);该引物包括两条外引物f3、 B3和两条内引物FIP、 BIP。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。该引物的核苷酸序列如 下F3: 5' -AAGCCGATGAAATGGTGATC-3 ，， B3: 5' -GTTCAAAGGCACCTCATCGA-3 ，；该方法适用的菊花品种为匍匐小菊，如粉地毯；大菊，如神马。 本专利技术的有益效果为1. 本专利技术不需要特殊仪器(如PCR仪)，较实验室常规律方法更快捷， 经济。2. 本专利技术鉴定简便，有极高的特异性，只要用肉眼观察或浊度仪紫外 成像系统检测沉淀浊度就能够判断目的片段扩增与否，从而判断出用于检 测的样品植株是否感染有番茄不孕病毒，而不必用凝胶电泳的方法来观察o附图说明图1:番茄不孕病毒的LAMP法反应产物和PCR法反应产物的电泳图。具体实施例方式实施例l:一种检测番茄不孕病毒的方法，该方法利用环介导等温扩增反应 (LAMP)检测番茄不孕病毒(TAV)。 该方法包括的步骤依次为A. 在1.5-2.0ml的Eppendof滑中配制反应体系；所用的溶剂为重蒸水 (ddH20);B. 将所述的反应体系进行温育处理，得到温育产物；该温育处理的温度为65。C，时间为30-80min，优选为60min;该温育处理在金属恒温混匀 仪中进行，也可以在水浴锅或金属浴中进行；C. 将所述的温育产物进行灭活处理，得到反应产物；该灭活处理的 温度为8(TC，时间为5-15min，优选为10min;该灭活处理在在金属恒温混 匀仪中进行；D. 将所述的反应产物进行检测，得到检测结果；检测的方法为可以是1.0%琼脂糖凝胶电泳检测；也可以使用比浊仪检测该反应产物的浊度变化，也可以用肉眼直接观察；也可以对该反应产物 中进行染色处理，该染色处理的方法为向该灭活产物中加入0.1U1的核 酸结合染料SYBR Green I，在紫外灯下观察如果反应产物呈现出荧光， 则证明样品中含有番茄不孕病毒。本实施例中所述的金属恒温混匀仪购自德国Eppendorf公司。 该方法适用的菊花品种为匍匐小菊，如粉地毯；大菊，如神马。 本实施例中采用的即环介导等温扩增反应(Loop- mediatedisothermal amplification, LAMP),是日本学者Notomi等开发的一种新颖的恒温核酸 扩增方法。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，LAMP反 应产生许多不同大小的条带，是由环状结构所构成的花椰菜样结构，条带 大小相差100bp左右,利用链置换DNA聚合酶(BstDNApoLymerase)在 等温条件(65。C左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。此方法较实 验室常用的RT-PCR更快捷，经济，不需要特殊仪器，其结果可以利用仪器 检测或肉眼观察核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀判定。目前,国外已有 较多的此类报道，如检测番茄黄曲叶病毒、番茄斑点枯萎病毒、肠侵袭性 埃希(氏)大肠杆菌、鸡蛋中沙门氏菌、河虾中白斑综合症病毒等,并建立了 专门的官方网站(http: / / loopamp.eiken.co.jp / e / tech /index.htm)。而国内起步较晚，2002年和2003年北京奶牛中心2次引进LAMP法检测胚胎的性别。 同时，人们还在不断对LAMP技术进行改良,使其能在疾病基因诊断、食品分析和环境监测等领域更好地发挥作用。本实施例中采用的LAMP法具有以下特点(l)高特异性应用6个区 段、4种引物，并且这6个区段的顺序也有规定。因此LAMP法扩增的特异 性很高，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否，即能够进行细 菌或病毒的定性检测。(2)只需一恒定温度就能扩增反应。不需要特殊试剂 以及昂贵的仪器，不需要预先进行双链DNA的变性。(3)快速、高效扩增 整个扩增在不到一个小时即可完成，且产率很高。若在引物上再进一步改 进，可大大提高其扩增效率，扩增时间在原来的基础上减少l /3 1 /2(4) 灵敏度高扩增模板可达1 10拷贝(5)鉴定简便在核酸大量合成时，从 dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg离子结合，产生副产物—— 焦磷酸镁沉淀。它有极高的特异性，只要用肉眼观察或浊度仪紫外成像系 统检测沉淀浊度就能够判断扩增与否。虽然对于某些病毒的检验,LAMP 法的灵敏度和特异性尚未超越特殊方法的PCR ;焦磷酸镁的浊度检测法其 灵敏度也低于琼脂糖凝胶电泳分析法;但是在很大程度上，LAMP法已经 符合了临床所需的要求。如果对LAMP法方法进行进一步完善、优化和推 广，该技术将会在在检测病毒方面具有广阔的应用前景。实施例2:本实施例是实施例1中所述的反应体系的组成。该反应体系中包括Beta本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测番茄不孕病毒（ＴＡＶ）的方法，其特征在于：该方法利用环介导等温扩增反应（ＬＡＭＰ）检测番茄不孕病毒（ＴＡＶ）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴忠义，王永勤，黄丛林，张秀海，李春华，梁宏霞，刘佳，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]