传染性胰脏坏死病毒的快速检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开一种传染性胰脏坏死病毒的快速检测试剂盒及其检测方法。本发明专利技术包括由Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶、逆转录酶、反应缓冲液、环介导等温扩增混合液、引物混合液和荧光显色剂共６种试剂组成的试剂盒，以及使用该试剂盒检测鱼类样品中传染性胰脏坏死病毒的一套检测操作程序，以实现对传染性胰脏坏死病毒快速检测的标准化，为鱼类的健康养殖和国际鱼类贸易的发展提供科学依据。本发明专利技术具有特异性好、灵敏度高、操作简便、高效等优点，可广泛的应用于水产养殖场以及进出口鱼类贸易中的现场即时检测，并可以为相关基础研究提供技术支持，具有广泛应用前景。

【技术实现步骤摘要】
传染幽離坏死病毒的舰微繊l戯離测方法狱领域本专利技术属于水产动物病原的检测技术，具体是一种^环介导^^扩增fe^:对鱼类传染Wffi坏死 病毒进行舰检测的试剂盒及離测方法。 背景狱传染l4Mfll主坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus，简称IPNV)属于双片段RNA病^4、水 ^^m殺RNA病毒属'可以引起鲑科 ^苗和幼鱼的急性传染病，是研^S早的^i毒病。IPNV 対7K产辭1^^了严重的危害，目前魏到加拿大、智利、艘、英国、法国、德国、意大利、日本、 南韩、挪威、劳將兰、瑞典、美国、中国等国家。易/ife^包括虹鳟、大西洋鲑、五条鲫、大,、欧 洲黄盖鲽、離業大西洋鳕等十余种常见辭直鱼类。患病鱼游动异常、体腿黑、目艮突出、腹部肿胀，腹 部包括JH奮出血.、鳃发白，有l彌iLE门^^长的、白色的術世物，内脏器官多处出现点状出血或 发白，肠道内无内含物。鉴于IPNV的严重危害性，世界动jtJ卫赵且织淑定其为必报樹离。中国国家质 翻督检验鹏总局与韩国海洋水/^于2005年发布加仲韩进出口活水生动t^验驗协议》中规定， 我国和韩国进出口的的舻鱼、真鋼、Mit、都渔、大^l平、牙邻等必须进行传染牲皿i^E病毒的检验检爽。目前fe^毒的检测方法主要包鄉胞学诊断技术、免疫学诊断技术、肝生物学诊断技术三大类。 细胞学诊断财主要包^g细胞歸分离病毒、组彌娜片及电鄉察，其操^M，翻啁账， 且灵鹏低；免疫学诊断辦主要包括免疫荧光检测、免疫点被，其方法具有特异性强、敏離高的 优点，但方法相当繁琐，不适宜X才大量样品进行检测；^T生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应 (PCR)，比较鹏、灵敏，但是需要昂贵的PCR仪器，另夕卜需要琼脂糖)鹏电泳，溴化乙锭^^见察 结果，溴化乙锭题癌物，对人術卩环趟有危害，^X污染问题比琉^重。环介导#^显扩增(Loq>MediatedIso1heimalAmpMcation, Mf尔LAMP)技术，是一种 性高、特 异性强的耙DNA快速检测方法，不需要昂贵的仪器，样品中含有少量的病原就能检出。环介导^T增目前已Mra^月于检测水产动物病原，如鱼對离毒(鱼1#血慰舞毒、传對Mft坏夕满毒、传染性itlfiL器官坏死病毒、锦鱼腕疹病毒)、X抓卜'病毒(《抓卩白斑it^魏毒、黄彌毒)、细菌(迟钝爱德华氏菌)等。据驗，目前尚未MOT环介导^a扩增技术对传染性f繊i^E病^a行^i检测附随。
技术实现思路
本专利技术的目的;l^f共一种利用环介导^r增技微测传染脚^ffi坏鄉毒的检测淑!l盒，3￡1野见有技术的不足，以满足5砂汤即H^t测的要求。本专利技术的另一目的^if共这^^则i^U盒的樹则方法，以方便 ￡*产#5赵^和国际 贸易中对传染l4^fli坏死病Mi行'I^I检测中的細。本专利技术的主要原理为LAMP S^:^f吏核IiM^，环境中的循环置對广增实J股將Em列的放 大，从而超ij樹则的目的。基本禾Mm敲f对耙基因的6个区域，设计2X报异性引物，同时可以设计l-2条环引物以加快反应速度，利用一种链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bacillus stearothomophilus DNA polymerase'简禾尔B欲DNA ^^S|)，在恒温65。C左右SjS^勺lh。 BstDNA^^^f^^性 一是具 有5'-3'聚儒活性，能在傲g狀态下扩增DNA核酸；二是BstDNA聚^H具有链置换活性，能将新合 成的核酸单1|/人新 的DNA双链上置树取代)下来，形成两斜拉的核酸单链以开启下^6的DNA 核酸洽成，进而免去了每次扩增前的DNA变性环节。LAMP反;翅:程中， 一对弓嫩的5'端含有一段 与下^T增产物互补的序列，因此，劍弓l物的单敏，多咸可形成'个类似观铃状的回文结构，这种结 构正好为下一^a置^T增i^Z樹共了一个可柳哥而复始嘲用的徽反，Bst DNA聚合酶^f链置换活 性，后阶段退火的引物置换前面引物所形成的链，从而保证了扩增的#^进行。LAMPHiS^成一系列 不同长度的具W^环结构的DNA产物，可OT3t荧^^料进行检测。 本专利技术的絲方案如下传染14KDK^1^毒的环介导^^广增快速检测微U盒，包括提供切5^领的BstDNA聚铺、逆 转录酶、Si^缓冲液、环介导等温扩增混合液、引物混合液和荧^M色剂，以i^ii乓-种^f顿该微嗆 检测鱼，品中传染脚，坏夕摘'毒的方怯，以实3^传染ffiKlt坏死病毒^I检测的标难化，为 传染F鹏顿病毒的检测提供一种'腿、简便、高效、实用的翻施。。本专利技术的传染幽瓣￡^毒的环介导等温扩增|^1检测试齐睑的配方如下淑[JA: BstDNA聚娜(8U/mL);淑UB:逆转鹏(200U/nL);淑U C: SlS缓冲液，樹共Bst DNA聚^SIftam^;^對乍用所必须的物质，其中含有200 mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲垸-盐酸(Tris-HCl)、 100 mmol/L氯化钾(KC1)、 100 mmol/L硫酸铵 ((NH4》S04)、 80mmol/L硫酸雙(MgS04)和1X曲拉通X-100 (TritonX陽100);试剂D:环介导等温扩增混合液，其中含有4.0ML2.5mmo]/LdNTP、 2.0nL10mol/L舌甘菜碱、0.5jjL 200U/hLRNA ,制剤和5-6mL針生物学MM7K;i叙'J E:弓l物混合液，其中含有2 pL20 Mmol/L正向内弓物、220 ^mol/L反向内弓物、1 5Mmol/L 正向夕卜弓嫩、lML5Mmol/L反向外引物和lML20Mmol/L环引物；其中引物序列分别如下 正向内弓嫩5'- GGCCCCGTTCAITGACTGGArnTGACAAGCCATACGTCCGC -3'; 反向内弓嫩5'- CGGAGGTACGAGATCGACCTCCnTTCCCTCGTAGAGAGTGGTGAG -3'; 正向夕卜弓l物5'- CCAAAGGAGTCACAGTCCTG -3'; 反向外引物5'-GTTGACGATGTCGGCGTT-3'; 环引物5'-TGGGGTGTCTCGTCCTCTA-3'。淑1JF:荧M色剂，成分为醇的荧光染料SYBRGREENI 。 采用传染蹈劍主坏歹膽毒的环介导等显扩堪叶ifcii齒则试剂盒的检测方法如下(1) 待检样品的RNA的提取.-用商业化的试剂盒或者传统的方^I取待检样品的RNA，用核酸分析仪测定RNA，保证其ODWOD280在1.7-2.0范围内，调整^ 度在100-200ng/^L之间。(2) 进行传染幽鹏讽病毒的环介导等尉广增鹏取一个0.2mL的聚丙烯塑料管，力口入1-2mL的歩驟(1)提取的待测样品的RNA，再加入lpL试 剂A,卞L试剂B， 2.5ML试剂C， 11.5-12.5pL试剂D， 8pL淑UE，使得切立&#|只为25pL。其中引 物序列分别如下正向内弓l物5'- GGCCCCGTTCAITGACTGGArnTGACAAGCCArACGTCCGC -3'; 反向内引物5'-CGGAGGTACGAGATCGACCTCCnTTCCCTCGTAGAGAGTGGTGAG-3'; 正向夕卜弓l本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种传染性胰脏坏死病毒的快速检测试剂盒，其特征在于试剂盒中包括试剂Ａ－Ｆ：　试剂Ａ：Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶，８Ｕ／μＬ；　试剂Ｂ：逆转录酶，２００Ｕ／μＬ；　试剂Ｃ：反应缓冲液，其中含有２００ｍｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ８．８的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、１００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾、１００ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸铵、８０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸镁和１％曲拉通Ｘ－１００；　试剂Ｄ：环介导等温扩增混合液，其中含有４．０μＬ　２．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ、２．０μＬ　１０ｍｏｌ／Ｌ甜菜碱、０．５μＬ　２００Ｕ／μＬ　ＲＮＡ酶抑制剂和５－６μＬ分子生物学级超纯水；　试剂Ｅ：引物混合液，其中含有２μＬ　２０μｍｏｌ／Ｌ正向内引物、２μＬ　２０μｍｏｌ／Ｌ反向内引物、１μＬ　５μｍｏｌ／Ｌ正向外引物、１μＬ　５μｍｏｌ／Ｌ反向外引物和１μＬ　２０μｍｏｌ／Ｌ环引物；其中引物序列分别如下：　正向内引物：５′－ＧＧＣＣＣＣＧＴＴＣＡＴＴＧＡＣＴＧＧＡＴＴＴＴＧＡＣＡＡＧＣＣＡＴＡＣＧＴＣＣＧＣ－３′；　反向内引物：５′－ＣＧＧＡＧＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＴＣＣＣＴＣＧＴＡＧＡＧＡＧＴＧＧＴＧＡＧ－３′；　正向外引物：５′－ＣＣＡＡＡＧＧＡＧＴＣＡＣＡＧＴＣＣＴＧ－３′；　反向外引物：５′－ＧＴＴＧＡＣＧＡＴＧＴＣＧＧＣＧＴＴ－３′；环引物：５′－ＴＧＧＧＧＴＧＴＣＴＣＧＴＣＣＴＣＴＡ－３′。　试剂Ｆ：荧光显色剂，成分为１００×的荧光染料ＳＹＢＲＧＲＥＥＮＩ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：岳志芹，李琼，梁成珠，朱来华，邓明俊，张太翔，辛学谦，刘荭，肖西志，凌宗帅，郑小龙，张健，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]