H5亚型禽流感病毒核酸检测方法及其试剂盒技术

Ｈ５亚型禽流感病毒核酸检测方法及其试剂盒，涉及一种病毒。提供一种操作简便、实验可靠性高、可进行实时检测、灵敏度高、特异性好、周期短的Ｈ５亚型禽流感病毒核酸检测方法和试剂盒。步骤：１）寻求Ｈ５亚型禽流感病毒特有的保守序列作为待测靶基因；２）设计合成一对特异性引物，引物长度为１８－３０ｂｐ；３）根据保守序列设计合成一对Ｙ型双链特异性荧光探针；４）使用步骤２中的一对特异性引物和步骤３中的Ｙ型双链特异性荧光探针及ＰＣＲ成份组成２０μＬ荧光ＰＣＲ反应体系的检测溶液，将荧光ＰＣＲ反应体系的检测溶液装入ＰＣＲ反应管；５）设置阳性对照模板和阴性对照模板，进行实时荧光ＰＣＲ反应，获得检测结果。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
Ｈ５亚型禽流感病毒核酸检测方法，其特征在于包括以下步骤：　　　　１）寻求Ｈ５亚型禽流感病毒特有的保守序列作为待测靶基因，保守序列为：　　　　ｃａｔｔ　　ｃｃａｃａａｃａｔａ　　ｃａｃｃｃｔｃｔｃａ　　ｃｃａｔｃｇｇｇｇａ　　ｇｔｇｃｃｃｃａａａ　　ｔａｔｇｔｇａａａｔ　　ｃａａａｃａｇａｔｔ　　　　ａｇｔｃｃｔｔｇｃｇ　　ａｃｔｇｇａｃｔｃａ　　ｇａａａｔａｃｃｃｃ　　ｔｃａａａｇａｇａｇ　　ａｇａａｇａａｇａａ　　ａａａａｇａｇａｇｇ　　ａｃｔａｔｔｔｇｇａ　　　　ｇｃｔａｔａｇｃａｇ　　ｇｔｔｔｔａｔａｇａ　　ｇｇｇａｇｇａｔｇｇ　　ｃａｇｇｇａａｔｇｇ　　ｔａｇａｔｇｇｔｔｇ；　　　　２）设计合成一对Ｈ５亚型禽流感病毒特异性引物，引物长度在１８～３０ｂｐ之间，一对Ｈ５亚型禽流感病毒特异引物序列为：　　　　上游引物：５′－ＣＡＴ　　ＴＣＣ　　ＡＣＡ　　ＡＣＡ　　ＴＡＣ　　ＡＣＣ　　Ｃ－３’　　１９ｂｐ　　Ｔｍ＝５０．７℃，　　　　下游引物：５′－ＣＡＡ　　ＣＣＡ　　ＴＣＴ　　ＡＣＣ　　ＡＴＴ　　ＣＣＣ　　Ｔ－３’　　１９ｂｐ　　Ｔｍ＝５１．７℃；　　　　３）根据保守序列设计合成一对Ｙ型双链特异性荧光探针，具体要求如下：　　　　ａ．Ｙ型双链特异性荧光探针的长度为１８～３０ｂｐ，退火温度为５０～７０℃；　　　　ｂ．标记荧光剂的链与保守序列完全匹配，另一条链标记淬灭剂；　　　　ｃ．两条链的３’端为了防止引发扩增反应需要封闭；　　　　ｄ．两条链的一个末端存在碱基完全不匹配，不匹配的碱基长度为２～１０ｂｐ；　　　　４）使用步骤２中的一对特异性引物和步骤３中的Ｙ型双链特异性荧光探针及ＰＣＲ成份组成２０μＬ荧光ＰＣＲ反应体系的检测溶液，将荧光ＰＣＲ反应体系的检测溶液装入ＰＣＲ反应管，每一ＰＣＲ反应管中的成份包括１．５～４．０ｍＭ　　ＭｇＣｌ↓［２］，０．１～３ｍＭ　　ｄＮＴＰｓ，１～３Ｕ　　Ｔａｑ酶，０．２～０．５Ｕ反转录酶，上下游引物各为０．２～０．６μＭ，２μｌ１０×ＰＣＲ缓冲液，荧光剂标记探针０．０５～０．３μＭ，粹灭剂标记探针０．０６～０．３６μＭ；　　　　５）设置阳性对照模板和阴性对照模板，进行实时荧光ＰＣＲ反应，获得检测结果，阳性对照模板为包含保守序列的ＭＳ２噬菌体，阴性对照模板为灭菌后的无离子水，实时荧光ＰＣＲ反应的条件为４２℃反转录１５～３０ｍｉｎ，９４℃预变性３～８ｍｉｎ后进入循环，循环程序为９４℃变性...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈亮，于广福，邵寒娟，张国广，窦敏，曾雅明，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]