鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记、引物及其获取方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记、引物及其获取方法和应用，鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，通过遗传分离群体验证，其与枯萎病基因的遗传距离更紧密，可以准确进行抗枯萎基因定位；采用几丁质酶基因扩增序列区域之间的序列差异，选择表型性状完全符合的SNP位点，获得鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，能有效弥补以往不能检测野生西瓜抗性资源的缺陷，最大限度解决了遗传背景差异带来的吻合度局限。

Identification of dCAPS markers, primers, methods and applications of Watermelon Fusarium Wilt

The invention discloses a dCAPS marker, identification of Watermelon Fusarium Wilt and its primer acquisition method and application, dCAPS identification of Watermelon Fusarium wilt, segregating populations verified by genetic, genetic distance and the wilt disease genes more closely and accurately wilt resistant gene location; amplified sequence sequence difference between regions with Chitinase select the SNP locus gene, phenotypic traits of full compliance, dCAPS marker identification of watermelon wilt disease, can effectively compensate the previous defects can not detect the wild watermelon resistant resources, the maximum solution coincides with limitations of genetic background differences.

【技术实现步骤摘要】
鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记、引物及其获取方法和应用
本专利技术属于基因定位与分子标记开发领域，特别地，涉及一种鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记、引物及其获取方法和应用。
技术介绍
我国西瓜(Citrulluslanatus)产量居世界第一，占世界总产的70％。西瓜产业在我国农业种植结构调整、农民增收以及提高人民生活水平等方面发挥着重要作用。可是，枯萎病严重制约西瓜产业的可持续发展，特别是近年来对西瓜高品质(高糖、产量等)的盲目追求导致市场大部分主栽西瓜品种对枯萎病丧失抗性。因此，在尖胞镰刀菌西瓜专化型1号生理小种是我国大部分地区的优势小种的大背景下，利用抗枯萎病种质资源，充分挖掘1号生理小种的西瓜抗病基因(Fon-1)、选育抗病品种对西瓜产业发展具有重要意义。为了能快速高效利用西瓜抗枯萎病基因，科研工作者先后开展了西瓜枯萎病抗病基因的定位及分子标记开发研究。2013年张屹等利用西瓜基因组测序信息开发了与抗病基因Fon-1精密连锁的4个CAPS/dCAPS标记：459624_fon(7716_fon)、458344_fon(7419_fon)、208089_fon(4451_fon)和502124_fon；2015年李娜等基于全基因组重测序信息开发了西瓜抗枯萎病基因精密连锁的Indel标记：Indel1_fon1；上述标记中，502124_fon的连锁性最高。但是随着自然群体扩大的有效验证，发现502124_fon的验证结果与实际抗性还是存在偏差，特别是在野生材料上不能得到有效验证。由于栽培西瓜的遗传背景比较单一，野生西瓜的抗性资源逐渐成为了育种家们所关注的重点，但上述所开发的分子标记只能针对栽培西瓜抗源的转育，导致如今的有些杂交品种和自然种质资源实际的抗性吻合度不够。
技术实现思路
本专利技术提供了一种鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记、引物及其获取方法和应用，以解决现有技术中抗枯萎病基因的分子标记与抗枯萎病基因的遗传距离较远，不能检测野生西瓜抗性资源的缺陷的技术问题。本专利技术采用的技术方案如下：一种鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，dCAPS标记的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO∶1～3的核苷酸碱基序列，SEQIDNO∶1～3的核苷酸碱基序列中，SEQIDNO∶1为野生西瓜抗病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列，序列表中SEQIDNO∶2为栽培西瓜抗病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列，序列表中SEQIDNO∶3为西瓜感病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列。根据本专利技术的另一方面，还提供了一种上述鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的引物，引物Rsa2-FR为：上游引物序列：5′-AAATAGAGGAAGACAAACCGTA-3′，下游引物序列：5′-TGTTAATGAAAATGTTCGAAGT-3′。根据本专利技术的另一方面，还提供了一种上述鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的获取方法，包括以下步骤：(1)供试材料选取，其中包括抗病材料和感病材料；(2)对步骤(1)中供试材料分别进行基因组DNA提取，得到供试材料的全基因组序列；将几丁质酶基因保守序列在供试材料的全基因组序列中进行Blast比对，获取供试材料中候选几丁质酶基因的位置及功能注释信息；(3)对步骤(2)中在供试材料上获取的候选几丁质酶基因分别设计引物进行全长扩增并测序；(4)对步骤(3)中获取的测序结果进行基因组序列比对，获取与供试材料表型性状完全符合的候选SNP位点，即为与供试材料抗枯萎病基因紧密连锁的候选SNP位点；(5)对步骤(4)中获取的候选SNP位点分别设计dCAPS标记，在验证材料中验证候选SNP位点，获得与供试材料抗枯萎病基因紧密连锁的dCAPS标记，即为鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记。进一步地，还包括在步骤(2)之前，选取典型的抗病材料和感病材料接种枯萎病病原菌并进行几丁质酶酶活测定的步骤。进一步地，对步骤(3)中全长扩增的产物分别进行验证，将产物中扩增出的片段与目的片段大小一致的全长扩增产物进行测序。进一步地，步骤(4)中候选SNP位点为FW-3基因3kb区间下游500bp内第38个SNP位点。进一步地，候选SNP位点的碱基突变为：由抗病材料的碱基“C”突变为感病材料的碱基“T”。进一步地，步骤(5)中对抗病材料的候选SNP位点分别设计dCAPS标记包括：对抗病材料的候选SNP位点分别设计引物，对其中的栽培西瓜抗病材料，将正向引物序列3′末端倒数第3个碱基“A”修饰变为“G”，与抗病材料的突变碱基“C”组成1个RsaI酶切位点，RsaI酶切位点为GTAC；对其中的野生西瓜抗病材料，引物序列不需要修饰；酶切后获取的核苷酸序列分别为序列表中的SEQIDNO∶4、SEQIDNO∶5、SEQIDNO∶6的核苷酸碱基序列。进一步地，步骤(1)中供试材料包括：父本CalhounGray、Sugarlee、PI296341-FR、PI482276，为典型的高抗枯萎病生理小种1西瓜材料；母本BlackDiamond、SugarBaby、W1402、PI595203，为典型的高感枯萎病生理小种1西瓜材料；进一步地，步骤(5)中验证材料包括：以上述抗、感材料中CalhounGray、PI296341-FR、BlackDiamond、W1402为亲本杂交获取的F1代群体；F1代群体自交获得CalhounGray×W1402264株F2代分离群体以及PI296341-FR×BlackDiamond113株F2代分离群体。根据本专利技术的另一方面，还提供了一种上述鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记或上述获取方法获得的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记在西瓜抗枯萎病分子辅助育种中的应用。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，通过遗传分离群体及自然群体验证，与西瓜枯萎病抗性基因Fon-1呈紧密连锁关系，其连锁距离为0.2cm，较502124_fon标记与西瓜枯萎病抗性基因Fon-1的连锁距离2.2cm更加紧密；更为重要的是该dCAPS标记能有效弥补以往不能检测野生西瓜抗性资源的缺陷，能够用于分子辅助育种，最大限度解决了遗传背景差异带来的吻合度局限，大大缩短了传统育种周期。2、本专利技术的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的获取方法，利用几丁质酶基因扩增序列区域之间的序列差异，选择与表型性状完全符合的SNP差异位点，获得鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，验证了几丁质酶含量的增加与植株的抗病性的关联性，筛选的西瓜枯萎病的dCAPS标记与西瓜抗枯萎病基因连锁距离更接近。利用鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，对目标性质基因进行间接选择，不受环境影响，不受等位基因显隐性关系干扰，选择结果可靠，从而达到作物产量、品质和抗性等综合性状的高效改良。本专利技术的西瓜枯萎病的dCAPS标记，除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本专利技术还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本专利技术作进一步详细的说明。附图说明构成本申请的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术优选实施例的接种枯萎病菌后不同西瓜根系组织内几丁质酶活的变化示意图；图2是本专利技术优选实施例的目标基因FW-3区间序列比对获取候本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，其特征在于，所述dCAPS标记的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO：1～3的核苷酸碱基序列，所述SEQ ID NO：1～3的核苷酸碱基序列中，SEQ ID NO：1为野生西瓜抗病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列，序列表中SEQ ID NO：2为栽培西瓜抗病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列，序列表中SEQ ID NO：3为西瓜感病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记，其特征在于，所述dCAPS标记的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO：1～3的核苷酸碱基序列，所述SEQIDNO：1～3的核苷酸碱基序列中，SEQIDNO：1为野生西瓜抗病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列，序列表中SEQIDNO：2为栽培西瓜抗病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列，序列表中SEQIDNO：3为西瓜感病材料dCAPS标记的核苷酸碱基序列。2.一种鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的引物，其特征在于，引物Rsa2-FR为：上游引物序列：5′-AAATAGAGGAAGACAAACCGTA-3′，下游引物序列：5′-TGTTAATGAAAATGTTCGAAGT-3′。3.一种权利要求1所述的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)供试材料选取，其中包括抗病材料和感病材料；(2)对所述步骤(1)中供试材料分别进行基因组DNA提取，得到所述供试材料的全基因组序列；将几丁质酶基因保守序列在所述供试材料的全基因组序列中进行Blast比对，获取所述供试材料中候选几丁质酶基因的位置及功能注释信息；(3)对所述步骤(2)中在所述供试材料上获取的候选几丁质酶基因分别设计引物进行全长扩增并测序；(4)对所述步骤(3)中获取的测序结果进行基因组序列比对，获取与所述供试材料表型性状完全符合的候选SNP位点，即为与所述供试材料抗枯萎病基因紧密连锁的候选SNP位点；(5)对所述步骤(4)中获取的候选SNP位点分别设计dCAPS标记，在验证材料中验证所述候选SNP位点，获得与所述供试材料抗枯萎病基因紧密连锁的dCAPS标记，即为所述鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记。4.根据权利要求3所述的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的获取方法，其特征在于，还包括在所述步骤(2)之前，选取典型的抗病材料和感病材料接种枯萎病病原菌并进行几丁质酶酶活测定的步骤。5.根据权利要求3所述的鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记的获取方法，其特征在于，对所述步骤(3)中全长扩增的产物分别进行验证，将所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张屹，梁志怀，李基光，朱菲莹，肖姬玲，魏林，
申请(专利权)人：湖南省农业生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：湖南,43