沙门氏菌菌苗制造技术

一种菌苗，它含有一种细菌，该细菌由于处于双成分调节系统控制下的一个基因进行组成型表达而使其毒力减低。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及菌苗。本专利技术是在政府支持下完成的，由国家健康研究院(NationalInstitute of Health)的No.AI 30479和No.00917款项资助。政府对本专利技术拥有法权。伤寒肠热病和腹泻(例如，伤寒和霍乱)是发展中国家高发病率以及高死亡率疾病的主要病因，参见Hook等人，1980，In Harrison′sPrinciples of Internal Medicine，9th Ed.，641-848，McGrawHill，New York。研制针对细菌疾病的菌苗的传统途径包括将纯化的成分或杀死的细菌进行非肠道注射。这些非肠道给药的菌苗需要比较先进的技术进行制备，并且相当昂贵，由于人们不愿进行针注射，因而经常受到患者的抵制。活的口服菌苗与非肠道菌苗相比有几方面的优点成本低，给药方便，以及制备简单。由于没有从分子水平上弄清所要对付的疾病的致病机理，因而常常限制了活疫苗的研制。候选的活菌苗菌株需要有不可逆转的遗传变化，这种遗传变化应该影响该有机体的毒性，但不影响免疫应答的诱导。基于毒素基因缺失的、解释霍乱弧菌的毒素产生机理的研究使得制备活菌苗菌株成为可能，参见Mekalanos等人，1983，Nature 306551，Levine等人，1988，Infect.Immun.56161。最近的研究已开始解释鼠伤寒沙门氏菌巨噬细胞生存及其毒力的分子基础，参见Miller等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA865054，引入本文作为参考。在正调节作用的调节子phoP中带有突变的鼠伤寒沙门菌菌株在对BALB/c小鼠的毒力方面已被明显地减弱。phoP调节子是由一个操纵子中存在的两个基因组成的，称为phoP和phoQ。 phoP和phoQ基因产物与细菌其他的两种成分转录调节器十分相似，它们应答环境中刺激并且控制许多其它基因的表达。在受phoP调节区调节的基因之一pagC发生的突变可使毒力欠缺。带有pagC，phoP或phoQ突变的菌株对随后受野生型伤寒沙门氏菌的攻击可提供部分保护作用。沙门氏菌引发的临床疾病包括伤寒肠热病以及急性胃肠炎，Hook等人，1980，文献同上。在受免疫抑制的人中由沙门氏菌引发的感染更普遍，Celum等人，1987，J.Infect.Dis.156998。引起伤寒的伤寒沙门氏菌仅能感染人，参见Hook等人，1980，文献同上。由于伤寒沙门氏菌的窄范围宿主特异性，因而将感染了鼠肠炎伤寒沙门氏菌(S.enteriditis typhimurium)的鼠广泛地用作伤寒的实验室模型，Carter等人，1984.J.Exp.Med.1391189。鼠伤寒沙门氏菌感染较宽范围内的宿主，可引起人类的急性胃肠炎以及在鼠和牛中引发类似于伤寒的疾病。沙门氏菌感染是通过口服摄食获得的。该生物体在穿过胃以后在小肠中繁殖，Hornik等人，1970，N.Eng.J.Med.283686。沙门氏菌能够侵入肠道粘膜细胞，并且伤寒沙门氏菌能够通过该粘膜障碍并通过派伊尔氏淋巴集结传播到粘膜固有层和局部淋巴结。然后在菌血症发生之后出现了宿主的网状内皮组织细胞移生。伤寒沙门氏菌能够在人网状内皮组织系统细胞内存活和复制对于其病理作用机理是必要的，Hook等人，1980，文献同上，Hornick等人，1970，文献同上，以及Carter等人，1984，文献同上。对伤寒沙门氏菌的免疫力包括体液和细胞介导的免疫，Murphy等人，1987，J.Infect.Dis.1561005，并且可通过免疫接种获得这种免疫性，Edelman等人，1986，Rev.Inf.Dis.8324。近来，人体内的试验证明，在用部分纯化的Vi抗原进行肌内免疫接种之后，具有明显的抵抗伤寒沙门氏菌感染的效果，Lanata等人，1983，Lancet 2441。已证明在接受了活伤寒沙门氏菌菌苗的个体中出现了T细胞对伤寒沙门氏菌的杀伤作用随抗体增加而加强，这种现象表明这些抗体对于宿主产生细胞介导的免疫应答可能是必要的，参见Levine等人，1987，J.Clin.Invest.79888。细胞介导的免疫应答对于伤寒免疫性是重要的，因为不能诱导这种免疫应答的死疫苗对人体没有保护性，Collins等人，1972，Infect.Immun.41742。本专利技术提供了不会引发瞬时菌血症的沙门氏菌菌苗。总的来说，本专利技术的特征是一种细菌细胞，优选的是一种沙门氏菌细胞，例如，一种伤寒沙门氏菌、鼠肠炎伤寒沙门氏菌或猪霍乱沙门氏菌细胞，通过在phoP调节子中进行第一突变以及在芳香族氨基酸合成基因中进行第二突变而使该细胞的毒力减低。本文所述的phoP调节子被定义为一种含有一个沙门氏菌毒力基因表达单位的DNA，该表达单位的特征在于有两个调节基因，phoP和pohQ，以及其表达受phoP和phoQ调节的结构基因，例如phoP调节区抑制的基因(prg)或phoP调节区激活的基因(pag)。这样的一种细菌细胞可用作菌苗。用于免疫接种一种哺乳动物使之抵抗沙门氏菌病。沙门氏菌细胞可以是任何血清型，例如，鼠伤寒沙门氏菌，甲型副伤寒沙门氏菌，乙型副伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，S.pylorum，都柏林沙门氏菌，海德堡沙门氏菌，纽波特沙门氏菌，明尼苏达沙门氏菌，婴儿沙门氏菌，维尔肖沙门氏菌或巴拿马沙门氏菌。第一个突变可以是在phoP/phoQ位点中的一个不可回复的无效突变。该突变优选的是至少100个核苷酸缺失；更优选的是，该突变缺失至少500个核苷酸；进一步优选的是，该突变至少缺失750个核苷酸；最优选的是，该突变缺失phoP/phoQ调节位点的第376至1322位核苷酸。第二个突变可以是在aroA位点中一个不可回复的无效突变，或在aroC/aroD位点中的一个不可回复的无效突变，或者是在涉及芳香族氨基酸生物合成的另一个位点的不可回复的无效突变。为了进一步降低本专利技术的细菌细胞的毒力，该细胞还可以在非芳香族氨基酸合成基因中含有另一突变(例如一个缺失)，例如，可以使细胞成为对于非芳香族氨基酸(例如组氨酸)的营养缺陷型。在优选实施方案中，本专利技术的细菌细胞是具有AroA-，His-，phoP/phoQ-基因型的伤寒沙门氏菌细胞，例如，TyLH445。本专利技术还可包括其毒力受处于双成分调节系统控制下的基因的组成型表达而降低的沙门氏菌细胞。在优选实施方案中，该组成型表达是双成分调节系统中的一种成分发生突变的结果。在优选实施方案中，细菌细胞包括能减低毒力的第二个突变。在该菌苗的其他优选的实施方案中，该双成分调节系统是phoP调节区，以及处于该双成分调节系统控制下的基因是phoP调节区调节的基因，例如，一种prg基因(例如prgA，prgB，prgC，prgE或prgH)，或pag基因(例如pagC)。在优选的实施方案中，组成型表达是在被调节基因的启动子或在phoP调节区的启动子中发生改变或突变(例如缺失(优选的是一种不可回复突变))的结果，例如在phoQ或phoP基因中的突变，例如phoPc突变。另一方面，本专利技术的特征在于一种包括细菌细胞的菌苗，该细菌通过phoP调节区(例如，一种prg基因，如prgA，prgB，prgC，prgE或prgH)的控制使本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：塞缪尔·I·米勒Ⅲ，约翰·J·梅卡兰诺斯，
申请(专利权)人：杰纳勒尔医疗公司，
类型：发明
国别省市：