多种病毒同步检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种同步检测六种病毒（ＨＩＶ１，ＨＣＶ，ＨＢＶ，ＨＣＭＶ，ＨＳＶ１和ＥＢＶ）多重ＰＣＲ的方法，其特点是通过合理设计引物和采用均一设计法（Ｕ↓［１０］↑［＊］（１０↑［８］）及其实验，优化引物浓度组合及ＰＣＲ条件，在同一个反应管中和同一个热循环条件下，对六种病毒中的１－６种进行扩增，并通过凝胶电泳分离和检测。该发明专利技术除具有经典ＰＣＲ的灵敏度、快速、简便等特点以外，主要是实现了血液中六种病毒的同步检测，成本更低，能用于开发相关试剂盒，用于血源质量控制、临床诊断和病毒流行病控制。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒的检测方法，更具体涉及一种多种人类病毒基因的同步检测PCR(聚合酶链式反应)方法。所说的多种病毒基因同步检测是指采用一套统一的试剂和同一个热循环程序，在同一个反应管中进行PCR扩增，检测多至六种重要的人类病毒。这些病毒包括乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，艾滋病毒一型(HIV1)，人类巨细胞病毒(HCMV)，单纯疱疹病毒一型(HSV1)和EB病毒(EBV)。它们对人类健康危害严重，导致各种恶性肿瘤或传染病。如HBV和HCV导致肝炎，HBV的感染率长期高达10％以上，大约90％的输血后肝炎由HCV引起。HIV1能导致爱滋病(AIDS)，AIDS是严重威胁人类生命的疾病之一，其病死率高于癌症，被认为是世纪超级癌症。HCMV是引起人类先天畸形的重要原因之一，它还可使细胞转化，可能与人的恶性肿瘤的发生有关。HSV能引起多种人类疾病，并被认为与宫颈癌的发生有关，其中单纯疱疹性脑炎(HSE)是一种死亡率很高的疾病。EBV感染十分普遍，与多种疾病相关，主要包括淋巴细胞增殖性疾病，非淋巴细胞的恶性肿瘤和自身免疫性疾病三大类，其中如鼻咽癌、Burkitt’s淋巴瘤、Hodgkin病和免疫缺陷相关淋巴瘤。所有这些病毒均可能通过血液传播。主要传播方式如输血和血液制品注射。因此，血源质量控制是阻止这类病毒及病毒病传播的重要环节。已经有许多方法用于检测血液中病毒，如细胞学方法，免疫学方法、基因诊断(基因探针、PCR)，等等。其中，以PCR法的灵敏度最高，如果能严格控制实验环境与条件，克服假阳性，PCR在临床上将被广泛使用。然而，现有的PCR方法每次扩增只针对一种病毒，如果有一份血样，要检测是否含有上述病毒中的一种或多种，则需要分别进行多次PCR反应，因而费时费力，耗费药品试剂多，检测成本高。随着卫生水平的提高，对血液质量的控制受到空前重视，对血液制品和血源的检测要求越来越高，指标也会增加，现有的PCR方法显然不能满足要求。学者们正在发展所谓多重PCR(Multiplex PCR)方法，即在一个试管中、在同一种反应条件下对两个或两个以上的不同靶基因进行同步扩增(Chamberlain，J．S_Gibbs，R．A_Rarier，J．E_Nguyen，P．N_and Caskey，C．T．(1988)Deletionscreening of the Dchennne muscular dystrophy locus via multiplex DNAamplification．Nucleic Acids Res．11141-11156)。这样能大大提高PCR的效率。该方法也被用于临床病毒的检测，相关的研究有爱滋病毒I和II型同步扩增(Udaykumar，Heredia A_Soriano，V_Bravo，R_Epstein，J．S_and Hewlett，I．K．(1994)Enhanced diagnostic efficiency of the polymerase chain reaction by co-amplification of multiple regions of HIV-1 and HIV-2．J．Virol．Methods 4937-46)，四种逆转录病毒的同步扩增(Heredia，A_Soriano，V_Weiss，S．H_Bravo，R_Vallejo，A_Denny，T．N_Epstein，J．S_and Hewlett，I．K．(1996)Development of amultiplex PCR assay for the simultaneous detection and discrimination of HIV-1，HIV-2，HTLV-I and HTLV-II．Clin．Diagn．Virol_785-92)，三种肝炎病毒(HCV、HBV-C／HGV)的同步扩增(Caudai，C_Padula，M．G_Bettini，V_and Valensin，P．E．(1998)Detection of HCV and GBV-C／HGV infection by multiplex PCR in plasmasamples oftransfused subjects．J．Virol．Methods，7079-83)。这些方法显然具有重要的临床应用价值。然而，随着靶基因数目的增加，加入的PCR引物对就越多，影响因数越复杂。例如，引物越多，存在同源序列可能性就越大，不同引物之间或引物与非靶基因之间发生区域碱基配对的机会就越多，从而干扰PCR；不同引物具有不同的Tm值(变性温度)，给热循环程序设计带来困难，多重PCR假阳性率或假阴性率远高出经典PCR。因此，必须对多重PCR进行条件优化，而优化过程往往需要做大量的实验。均匀设计是一种建立在均匀分布理论上的实验设计方法，比正交设计效率更高。例如，对于一个6因素、10水平的实验，所有可能性组合的实验次数为106，正交实验至少需要1000次，而均匀设计只要10次，而所获得的结果近似。(Fang K．T_and Wang，Y．(1993)Number-Theoretic Methods in Stastistics，Chapman and Hall，London；Tian G．L_and Fang，K．T．(1999)Uniform designs formixture-amount experiments and for mixture experiments under order restrictions．Sciences in China Ser．A．42456-470；Wang，Y_and Fang，K．T．(1996)Uniformdesign of experiments with mixtures．Sciences in China Ser．A．39264-275)。均匀设计表表示为U*x(Xy)，x为最大因子数，Y为水平数，*为新的均匀排布。每个均匀设计表附有一个应用表，指示从均匀分布表中选择哪一栏来设计实验。均匀设计由于效率高，已经成功地在药物设计和微生物发酵中获得应用(Zhang W_Yu X．J_and Yuan，Q．(1994)Uniform designa new approach of design fermentationmedia．Bio／Techniques，7379-384．)。本专利技术的目的是提供了一种，该方法通过设计专用扩增引物，给出六种病毒的同步检测的多重PCR条件，该方法易行，能快速、简便地同步检测血液中六种病毒。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术措施设计合适的引物，使引物之间不发生干扰，并具有相似的扩增条件；将目标集中PCR引物浓度上，它是影响多重PCR的关键因素，固定其它反应条件，采用均匀设计方案，用较少的实验次数优化引物浓度；利用优化的条件对所有6种病毒同时或单独地进行保守基因扩增，进而通过琼脂糖凝胶电泳分离和检测相应的病毒。其步骤是A．设计一套用于同步扩增六种病毒HIV1、HCV、HBV、HCMV、HSV和EBV的引物，各引物针对相应病毒高度保守基因，不同引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多种病毒同步检测的方法，该方法包括以下步骤：Ａ．设计用于同步扩增六种病毒ＨＩＶ１、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＣＭＶ、ＨＳＶ和ＥＢＶ的引物，各引物针对相应病毒高度保守基因，引物的退火温度为５６℃－６４℃，引物两两之间无三碱基以上之互补，ＰＣＲ 产物两两长度之差大于３０－５０ｂｐ；Ｂ．多重ＰＣＲ引物浓度的均匀设计，将扩增病毒每个靶基因的一对引物定义为一个因素，设因素的水平范围为０．１μｍｏｌ／Ｌ－０．６μｍｏｌ／Ｌ，共１０个水平，均匀设计表为Ｕ↓［１０］↑［＊］（１０↑［８］） ，通过凝胶电泳分离检测多重ＰＣＲ结果；Ｃ．六种病毒ＨＩＶ１，ＨＣＶ，ＨＢＶ，ＨＣＭＶ，ＨＳＶ１和ＥＢＶ基因同步检测的ＰＣＲ，反应体积３０μｌ，Ｔａｑ酶１．５Ｕ，缓冲液：１×，Ｍｇ＋＋：２．５ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰｓ３００μｍｏｌ／Ｌ，引 物微摩尔浓度组合为：＊＊＊反应在ＰＥ４８０热循环仪上进行，热循环条件：９４℃、３分钟，１个循环；９４℃、１分钟，５０℃、１分钟，７２℃、２分钟，３０个循环；９４℃、１分钟，５０℃、１分钟，７２℃、７分钟，１个循环。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张先恩，陶生策，刘虹，李天宪，张治平，胡勤学，梁布锋，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]