异色瓢虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合及其应用制造技术

本发明专利技术公开了异色瓢虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合及其应用。具体地，异色瓢虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合方案为：不同温度条件下稳定表达的内参基因组合为18S、28S和GAPDH，不同光周期条件下组合为18S、28S和HSP90，不同龄期组合为18S、28S和HSP70，不同组织组合为18S、28S和RP49。本发明专利技术首次确定了异色瓢虫在四种因子下最稳定的内参基因组合，为研究异色瓢虫不同温度条件下、不同光周期条件下、不同龄期和不同组织的基因表达水平提供了内参基因的选择依据，为研究异色瓢虫的基因功能以及RNAi转基因作物环境风险评估等方面建立了坚实的基础。

A combination of reference genes with stable expression of Harmonia axyridis in different factors and its application

【技术实现步骤摘要】
异色瓢虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合及其应用
本专利技术属于昆虫分子生物学研究
更具体地，涉及异色瓢虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合及其应用；包括异色瓢虫在不同龄期、不同组织中以及不同温度和不同光周期稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用。
技术介绍
异色瓢虫Harmoniaaxyridis在亚洲很多国家广泛分布，后引入或扩散到欧洲、美洲，是全世界范围内多种农业生态系统中广泛分布，十分常见的捕食性天敌昆虫，目前作为一种重要的生防天敌，在全世界农业生产中广泛应用。其成虫和幼虫可捕食多种蚜虫、蚧虫、木虱、蛾类的卵及小幼虫、叶甲幼虫等，也会捕食食蚜蝇幼虫等。此外它还能捕食其它瓢虫，食物不足时还会自相残杀。在作物的开花期，其还有取食花粉的习性。这样，在作物田异色瓢虫可能通过取食猎物间接地暴露于转基因抗虫作物如RNAi转基因玉米表达的dsRNA；通过取食花粉而直接地暴露于作物表达的dsRNA。因此，该天敌昆虫作为指示性生物已被广泛用于转基因抗虫植物环境安全研究。然而，目前还没有可用于评价dsRNA对异色瓢虫直接毒性影响的技术体系。RT-qPCR(Reversetranscriptase-quantitativepolymerasechainreaction)是在各种生物过程中量化基因表达的一种可靠技术，是最广泛使用的进行核酸检测和定量的分子技术，而这需要一套稳定的内参基因来标准化得到的数据。虽然RT-qPCR是目前量化基因表达最高效、可靠和可重复的方法，然而，由于缺乏透明度、标准化和技术/质量对照，这远不是一个“黄金标准”；依然存在几个因子如RNA样品的质量和完整性，cDNA合成和PCR效率，在数据分析时会显著影响基因表达的标准化程度。Hellemans和Vandesompele估计在10-25％的个案研究中，如果选取了两个随机的非验证过的内参基因进行目的基因的定量实验，表达量平均会有3和6倍之间的差异。这种不一致使得它不可能得出一个与生物现象或临床的相关的结论。为了避免偏见的常态化，越来越多的研究者开始接受使用参考基因去分析目的基因的表达，使用一个或多个稳定的内参基因是规范RT-qPCR数据最常用的方法。另外，尽管在RT-qPCR研究中，已经证实对内参基因的系统性研究是非常必要的，然而针对生防天敌的内参基因标准化研究却十分缺乏。作为一大类直接暴露于以RNAi为基础的杀虫剂和转基因作物环境中的非靶标生物，生防天敌值得我们特别关注。内参基因及其最佳数量的确定通常要在准确度和实用性之间产生一个权衡。在一定的实验条件下，如果分别选取了最稳定和最不稳定的内参基因进行定量实验时，目标基因的表达会有动态的改变。这提供了一个在特定的实验条件下，选择最合适的内参基因的案例，当选用不同内参基因作为比较测量时，可以产生不同的结果。在选取了不同内参基因的条件下，可以显著影响目标基因表达的结果，从而在特定条件下进行基因表达实验时，首先进行内参基因的验证。因此，内参基因的选择确定对于相关实验研究的结果具有至关重要的影响作用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有异色瓢虫分子生物学研究过程中内参基因方案的缺乏，提供异色瓢虫在不同因子下稳定表达的内参基因及其应用；包括异色瓢虫在不同龄期、不同组织中以及不同温度和不同光周期稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用。本专利技术的目的是提供一种异色瓢虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合。本专利技术另一目的是提供一种异色瓢虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合的筛选方法。本专利技术再一目的是提供所述异色瓢虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种异色瓢虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合，具体方案为：异色瓢虫在不同温度条件下稳定表达的内参基因组合为18S、28S和GAPDH；异色瓢虫在不同光周期条件下稳定表达的内参基因组合为18S、28S和HSP90；异色瓢虫不同龄期稳定表达的内参基因组合为18S、28S和HSP70；异色瓢虫不同组织稳定表达的内参基因组合为18S、28S和RP49。本专利技术提供的上述内参基因组合为研究异色瓢虫不同温度条件下、不同光周期条件下、不同龄期和不同组织的基因表达水平提供了内参基因的选择依据。一种异色瓢虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合的筛选方法，首先分别设计9个内参基因ACTB、GAPDH、ATP6V1A、18S、28S、ATP1A1、HSP70、HSP90、RP49的特异性RT-qPCR引物，上下游引物序列依次如SEQIDNO.7～24所示；然后以不同因子条件下的异色瓢虫的cDNA为模板，分别利用所述RT-qPCR引物对9个内参基因进行RT-qPCR分析，确立不同因子条件下最稳定表达的内参基因。具体优选地，所述异色瓢虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合的筛选方法包括以下步骤：S1.异色瓢虫的饲养：异色瓢虫为实验室饲养种群，饲养在人工气候箱中，饲养条件为23℃、50％的RH、光周期14L：10D；S2.获得ACTB、GAPDH、ATP6V1A内参基因序列：设计了3个内参基因ACTB、GAPDH、ATP6V1A的兼并引物，其上下游引物序列依次如SEQIDNO.1～6所示，PCR克隆得到3个内参基因ACTB、GAPDH、ATP6V1A的序列；S3.设计特异性RT-qPCR引物根据步骤S2获得的3个内参基因序列以及从NCBI数据库获取18S(GU073689)、28S(FJ621330)、ATP1A1(AY303371)、HSP70(EF668009)、HSP90(FJ501962)、RP49(AB552923)的6个内参基因的序列，设计特异性RT-qPCR引物，上下游引物序列依次如SEQIDNO.7～24所示，并利用PCR溶解曲线确定其引物扩增的特异性，并设置5倍梯度稀释建立标准曲线，确定每队引物的扩增效率；S4.内参基因的RT-qPCR分析以不同温度条件下和不同光周期条件下处理的异色瓢虫，以及不同龄期或不同组织的异色瓢虫的cDNA为模板，分别利用上述SEQIDNO.7～24所示的9个引物对进行RT-qPCR分析，荧光染料为SYBRGreenI，确立最稳定表达的内参基因。其中，优选地，步骤S2中PCR反应体系为：10μl5×PCRBuffer(Mg2+Plus)，1μldNTPmix，上下游引物各5μl(10μM)，以及0.25μlofGoTaq(5u/μl)(Promega)，ddH2O补足50μl。优选地，步骤S2中PCR扩增的反应条件为：94℃，3min；94℃，30s，55℃，1min，共35个循环；72℃延伸1min，8℃保存。优选地，步骤S2中基因序列的克隆方法，包括以下步骤：纯化PCR产物，琼脂凝胶回收目的片段，将纯化产物连接到载体pCR4TOPO(Invitrogen,Carlsbad,CA)上，然后转化到大肠杆菌感受态细胞TOP10中，37℃平板培养过夜，对所获得的阳性克隆进行序列测序，测序所得的序列与NCBI数据库进行Blast比较分析，进而确定所得的核苷酸序列为异色瓢虫内参基因序列。优选地，步骤S4不同样本cDNA的获取方法是：分别提取10℃、22℃、30℃处理3小时的3龄幼虫以及16L：8D、12L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种异色瓢虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合，其特征在于，异色瓢虫在不同温度条件下稳定表达的内参基因组合为

【技术特征摘要】
1.一种异色瓢虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合，其特征在于，异色瓢虫在不同温度条件下稳定表达的内参基因组合为18S、28S和GAPDH；异色瓢虫在不同光周期条件下稳定表达的内参基因组合为18S、28S和HSP90；异色瓢虫不同龄期稳定表达的内参基因组合为18S、28S和HSP70；异色瓢虫不同组织稳定表达的内参基因组合为18S、28S和RP49。2.一种异色瓢虫在不同因子下稳定表达的内参基因组合的筛选方法，其特征在于，首先分别设计9个内参基因ACTB、GAPDH、ATP6V1A、18S、28S、ATP1A1、HSP70、HSP90、RP49的特异性RT-qPCR引物，上下游引物序列依次如SEQIDNO.7～24所示；然后以不同因子条件下的异色瓢虫的cDNA为模板，分别利用所述RT-qPCR引物对9个内参基因进行RT-qPCR分析，确立不同因子条件下最稳定表达的内参基因。3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.异色瓢虫的饲养：异色瓢虫为实验室饲养种群，饲养在人工气候箱中；S2.获得ACTB、GAPDH、ATP6V1A内参基因序列：设计了3个内参基因ACTB、GAPDH、ATP6V1A的兼并引物，其上下游引物序列依次如SEQIDNO.1～6所示，PCR克隆得到3个内参基因ACTB、GAPDH、ATP6V1A的序列；S3.设计特异性RT-qPCR引物针对3个内参基因ACTB、GAPDH、ATP6V1A以及从NCBI数据库获取的6个内参基因18S、28S、ATP1A1、HSP70、HSP90、RP49，设计特异性RT-qPCR引物，上下游引物序列依次如SEQIDNO.7～24所示；S4.内参基因的RT-qPCR分析以不同温度条件下和不同光周期条件下处理的异色瓢虫，以及不同龄期或不同组织的异色瓢虫的cDNA为模板，分别利用上述SEQIDNO.7～24所示的9个引...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘慧鹏，杨春晓，邱宝利，吴建辉，桑文，王兴民，金丰良，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44