一种控制猪后代幼体数量的方法技术

本发明专利技术公开了一种控制猪EAA基因等位基因分布和遗传多样性的方法，包括：（a）确定猪的血型;和（b）使用步骤（a）中确定的血型，穿过具有杂合血型的猪和具有纯合血型的猪。步骤（a）还包括以下步骤：（i）从猪的组织中提取基因组DNA;和（ii）使用外显子8作为模板的引物在步骤（i）中提取的基因组DNA中扩增外显子8，并进行外显子8的扩增。

A method for controlling the number of young porcine offspring

The invention discloses a method for controlling the allelic distribution and genetic diversity of pig EAA gene, including: (a) determining the blood type of pig; and (b) using the blood group determined in step (a), passing through the pig with heterozygous blood type and the pig with homozygous blood type. Steps (a) also include the following steps: (I) extract genomic DNA from pig tissues; and (II) use exon 8 as template primer to amplify exon 8 in genomic DNA extracted from step (I) and amplify exon 8.

【技术实现步骤摘要】
一种控制猪后代幼体数量的方法
本专利技术涉及一种用于分析猪的EAA基因型和具有合适血型的猪的控制猪的数量的方法。
技术介绍
与人ABO血型相关的基因在哺乳动物物种中是很好的保守的。然而，这些基因的生物学意义尚未阐明。一般来说，红细胞血型抗原和针对它们产生的抗体是输血医学中的主要问题之一。这是因为红细胞血型抗原在通过输血暴露于另一个体（人或猪）时通过诱导抗体形成而引起造血输注副作用，因此红细胞抗原和抗体的存在或不存在是重要的这是因为它是一个因素。输血是将患者的免疫系统暴露于存在于血液中的大量同种异体抗原的器官移植，其是将供体的血细胞或血浆成分注入患者的治疗作用。由于由细胞表面上的糖基转移酶形成的寡糖（包括红细胞），可以通过特异性同种异体抗体鉴定ABO血型，可用于评估输液或移植药物中的组织相容性。人类ABO基因（组织-血型ABO基因）的直向同源物被报道在各种哺乳动物中，包括狗，猫，兔，家畜猪，绵羊，大鼠，仓鼠，红细胞抗原A（EAA）是在猪中发现的osolog，可以根据存在或不存在抗原决定簇是否存在与人血型A抗体的交叉反应性来确定基因的产生。由于缺乏器官移植的人类供体，猪组织进入人类的种间移植是非常有意义的。因此，清楚了解传染病和血型的概况，可以帮助患者避免与人体血液供应相关的许多问题。人类有三个主要的等位基因，包括A，B和O，ABO型血型，猪只有A和O等位基因，已知有AO型血型。猪的红细胞抗原A（EAA）基因是猪ABO基因的直系同源物，两个或更多个基因从同一基因分离并具有相同的同一性。在猪至人的异种移植中使用0型血型的猪可以帮助克服由ABO抗原差异引起的免疫并发症。ABO抗原不是主要的基因产物，而是称为糖基转移酶的酶的酶反应产物。ABO血型是在红细胞或其他细胞表面表达的粘蛋白糖蛋白或糖蛋白聚糖的聚糖。作为糖脂复合碳水化合物结构多态性的结果。在人类中，A[GalNAcalpha1-3(Fucalpha1-2)galactose]和B[Galalpha1-3(Fucalpha1-2)galactose]抗原由ABO血型的不同等位基因通过编码的A和B转录酶（转移酶）合成。另一方面，由O等位基因编码的转运酶是无功能的，并且保留为受体(Hantigen:Fucalpha1-2galactose)而不进一步修饰。ABO血型基因由人类基因组DNA中的8个外显子和20kb以上的跨度组成。基因在不同物种中保守性很好，通过框架移位或缺失来破坏外显子8位点可诱导人和猪基因功能的突变，外显子8已被证明起重要作用。各种研究已经显示人类A，B和O等位基因和基因型的频率存在差异，已经有各种各样的尝试来分析具有不同基因分布的个体之间疾病风险的关联。然而，其他物种的等位基因分布尚未得到研究，虽然O等位基因在某些群体中似乎相当频繁，但传统上，携带这种糖基转移酶非等位基因的个体（表型异常）的表型异常还没有报道。因此，涉及血型的基因功能的生物相似性研究是脆弱的。
技术实现思路
本专利技术是为了解决上述现有技术的问题而提出的，其目的在于提供一种控制猪EAA基因等位基因分布和遗传多样性的方法。根据本专利技术的一个方面，提供了一种用于检测猪的血型的方法，包括：（a）确定猪的血型;和（b）使用步骤（a）中确定的血型，穿过具有杂合血型的猪和具有纯合血型的猪。步骤（a）还包括以下步骤：（i）从猪的组织中提取基因组DNA;和（ii）使用外显子8作为模板的引物在步骤（i）中提取的基因组DNA中扩增外显子8，并进行外显子8的扩增。以及确认是否存在异常的步骤。外显子8的序列是SEQIDNO：1。另外，引物是一对Fa（5'-CGCCAGTCCTTCACCTACGAAC-3'）和Ra（5'-CGGTTCCGAATCTCTGCGTG-3'）;Fo（5'-AATGTCCTTATGCTGGCCTGG-3'）和Ro（5'-AACAACACACTCCTGAACAACAGA-3'）对;SFa（5'-CTGTCTCAGGCTTACATTCC-3'）和Ra（5'-CGGTTCCGAATCTCTGCGTG-3'）对;（5'-GTAGCTGTAGCCACTGGCCT-3'）和Ro（5'-AACAACACACTCCTGAACAACAGA-3'）对;F8（5'-ATACGTGGTCTTCCTGAAGC-3'）和R8（5'-TCATCGGTTCCGAATCTCTG-3'）。附图说明图1为本专利技术的SEQIDNO：1。具体实施例动物和DNA制备：选用A，B，C和D一共4头猪。进行EAA基因的遗传表征进行定时交配，选择的AO杂合子通过天然杂交繁殖。使用超声波扫描仪检查怀孕的成功。怀孕后30天将孕猪麻醉，剖宫产收集胎儿。1mL的外周血或0.5g的全组织在55℃的裂解缓冲液中孵育6小时，并根据标准化程序分离DNA。使用含有0.5％SDS的10mMTris-HCl（pH8.0）和0.1MEDTA（Promega，Wis.USA）和10μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K作为裂解缓冲溶液。EAA和ESR1基因性状分析（遗传性状分析）50（PCR）使用PCR扩增系统（Thermocycler）扩增了10mMTris（pH8.3），50mMKCl，1.5mMMgCl2]和0.5USuperthermTMDNA聚合酶（JMRHoldings，Kent，UK）3000，Biometra，Göttingen，Germany）。此外，通过在含有1XTAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶上电泳确认PCR扩增产物。凝胶用溴化乙锭染色，并在紫外光下观察。使用半嵌套PCR分析胚胎细胞的AO血型基因的遗传性状。加入到含有10mMTris-HCl（pH7.5），0.2μg/μL蛋白酶K，0.9％TWEEN-20,0.9％TritonX-100,2mMDTT的5μL裂解缓冲液中。培养胚胎。培养物在65℃下分别孵育10分钟和95℃10分钟。对于EAA外显子8的初级扩增，使用1μL的囊胚溶液作为模板DNA，除了使用Fa和Ra的A和O等位基因特异性引物和Fo和Ro外，进行PCR。使用所有2μL的第一个扩增的PCR产物进行二次PCR。使用A等位基因的SFa和Ra的二级引物和O等位基因的SFo和Ro。PCR条件由94℃初始转化1分钟，95℃初始转化3分钟。EAA外显子8的多态性分析：为了扩增EAA外显子8，使用F8和R8引物。PCR条件是在95℃下在94℃下1分钟初次变形3分钟，随后进行35个循环的3步骤，66℃退火1分钟，并在72℃下与每个引物孵育1分钟，然后在72℃下最后孵育10分钟。扩增片段克隆到pGEM-TEasy载体中。使用电穿孔装置（MicroPulser，Bio-Rad，California，USA）将连接产物用DH10B细胞（Invitrogen，California，USA）电穿孔。使用引物（T7-TAATACGACTCACTATAGGG和SP6-ATTTAGGTGACACTATAG）进行菌落PCR扩增克隆的插入片段。将2μLPCR产物用4U的核酸外切酶I，Fermentas，Baden-Württemberg，Germany和0.8U的虾碱性磷酸酶（USBcorporation，Ohio，USA）消化37℃3分钟，使未反应的dNTPs在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种控制猪后代幼体数量的方法（a）确定猪的血型；（b）使用步骤（a）中确定的血型来杂交具有杂合血型的猪和具有纯血类型的猪。

【技术特征摘要】
1.一种控制猪后代幼体数量的方法（a）确定猪的血型；（b）使用步骤（a）中确定的血型来杂交具有杂合血型的猪和具有纯血类型的猪。2.如权利要求1所述的方法，其中杂合子血型为AO血型，纯合血型为OO型血型。3.如权利要求2的方法，其中步骤（a）还包括以下步骤：（i）从猪的组织中提取基因组DNA;和（ii）使用外显子8作为模板，在步骤（i）中提取的基因组DNA中使用引物扩增外显子8，并进行外显子8的扩增，所述外显子8的序列是SEQIDNO：1，所述引物是一对Fa（5'-CGCCAGTCCTTCACCTACGAAC-3'）和Ra（5'-CGGTTCCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆幸福，
申请(专利权)人：安徽创丰现代农业开发有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34