一种金边土鳖快速鉴别方法技术

本发明专利技术公开了一种金边土鳖快速鉴别方法，通过针对金边土鳖的特征引物的聚合酶链式反应，对金边土鳖进行快速鉴别。利用PCR法对金边土鳖的DNA序列进行分析，找出其中的特异性位点，从物种的分子水平上对金边土鳖进行鉴定，能够准确、快速、有效地区分金边土鳖及其同属动物的混淆品。本发明专利技术金边土鳖快速鉴别方法能够简单、准确、直接地鉴别金边土鳖，只需微量的用量即可检测，并具有灵敏度高，稳定性好，特异性强的特点，用于制药过程中金边土鳖药材快速质量控制。

A method for rapid identification of wood louse in Phnom Penh

【技术实现步骤摘要】
一种金边土鳖快速鉴别方法
本专利技术涉及药材鉴别领域，具体涉及一种金边土鳖快速鉴别方法。
技术介绍
金边土鳖为昆虫纲蜚蠊目姬蠊科昆虫金边土鳖OpisthoplatiarientalisBurm干燥虫体，具有破血逐瘀、续筋接骨的功效。由于临床用量不断增加，国内市场需求量持续加大，导致伪劣混杂，不法商人以次充好，以假乱真。其中同属动物地鳖、冀地鳖和东方潜龙虱是最常见的混淆品，这些品种成分相似，经打粉入药后，仅仅靠传统的形态分析已难以辨认。而现行地方中药材标准中收载的金边土鳖的薄层鉴别方法，是对其氨基酸类成分进行鉴别，专属性差，无法将地鳖、冀地鳖和东方潜龙虱等混淆品和金边土鳖有效地区分开来。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术公开了一种金边土鳖快速鉴别方法。利用PCR法对金边土鳖的DNA序列进行分析，找出其中的特异性位点，从物种的分子水平上对金边土鳖进行鉴定，能够准确、快速、有效地区分金边土鳖及其同属动物的混淆品。本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案是：一种金边土鳖快速鉴别方法，通过针对金边土鳖的特征引物的聚合酶链式反应，对金边土鳖进行快速鉴别。其包括以下步骤：步骤一、将收集的各批供试药材分别取总DNA；步骤二、取特征引物P3，P4加无菌水稀释；步骤三、通过PCR反应程序获得扩增产物；步骤四、扩增产物与6×Loadingbuffer混匀后点于琼脂糖凝胶上，置于紫外灯下观察，拍照并保存；步骤五、照片中显示正品金边土鳖在250bp～500bp之间有一条清晰条带，其他混淆品在该位置均无条带，阴性无干扰。所述步骤一中，将各批供试药材，经75％乙醇擦拭表面，晾干，用研钵研磨成粉末，取研碎后的粉末25mg，用DNeasyBlood&TissueKit提取试剂盒提取试剂盒提取总DNA，备用。所述步骤二中，取特征引物P35'-CTGGCTGAGGGTCG-3'，P45'-ATCTGGGGGGTATG-3'加无菌水稀释成10μmol/μL，备用。所述步骤三中，PCR扩增：50μl体系中含有浓度为10μmol的P3、P4上下游引物各1μL，模板DNA2μL，PrimeSTARHS(Premix)聚合酶预混体系25μL，剩余体积用无菌蒸馏水补足。所述步骤四中，取扩增产物5μL，与6×Loadingbuffer1.0μL混匀后点于0.75％琼脂糖凝胶上，用1×TAE电泳缓冲液在90V电压恒压电泳30min；取出凝胶，置于紫外灯下观察，并用CAMAG成像系统拍照并保存。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火15s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min；获得扩增产物。其还包括以下步骤：步骤六、对步骤一至步骤五进行耐用性考察，分别考察方法的重复性和DNA聚合酶对该金边土鳖快速鉴别方法的影响，分别取同一批样品重复进行6次试验、更换DNA聚合酶为Taq聚合酶。所述步骤六中，Taq聚合酶PCR体系：50μL体系中含有浓度为10μmol的P3、P4上下游引物各1μL，模板DNA2μL，Taq聚合酶预混体系25μL，剩余体积用无菌蒸馏水补足。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。PCR扩增反应在ABIVeriti梯度PCR仪上进行；PCR完成后，取5μL产物进行电泳检测，电泳条件为电压90V，电泳时间30min。本专利技术的有益效果为：本专利技术金边土鳖快速鉴别方法能够简单、准确、直接地鉴别金边土鳖，只需微量的用量即可检测，并具有灵敏度高，稳定性好，特异性强的特点，用于制药过程中金边土鳖药材快速质量控制。下面结合附图与具体实施方式，对本专利技术进一步说明。附图说明图1体现了PrimeSTARHS(Premix)聚合酶进行鉴别的结果；图2体现了PremixTaq聚合酶进行鉴别的结果；图3体现了重复性试验的结构；图4为特征引物在序列中的位置。具体实施方式实施例，参见图1至图4，本实施例提供的一种金边土鳖快速鉴别方法，通过针对金边土鳖的特征引物的聚合酶链式反应，对金边土鳖进行快速鉴别。其包括以下步骤：步骤一、将收集的各批供试药材分别取总DNA；步骤二、取特征引物P3，P4加无菌水稀释；步骤三、通过PCR反应程序获得扩增产物；步骤四、扩增产物与6×Loadingbuffer混匀后点于琼脂糖凝胶上，置于紫外灯下观察，拍照并保存；步骤五、照片中显示正品金边土鳖在250bp～500bp之间有一条清晰条带，其他混淆品在该位置均无条带，阴性无干扰。如图1所示。所述步骤一中，将各批供试药材，经75％乙醇擦拭表面，晾干，用研钵研磨成粉末，取研碎后的粉末25mg，用DNeasyBlood&TissueKit提取试剂盒提取试剂盒提取总DNA，备用。所述步骤二中，取特征引物P35'-CTGGCTGAGGGTCG-3'，P45'-ATCTGGGGGGTATG-3'加无菌水稀释成10μmol/μL，备用。所述步骤三中，PCR扩增：50μl体系中含有浓度为10μmol的P3、P4上下游引物各1μL，模板DNA2μL，PrimeSTARHS(Premix)聚合酶预混体系25μL，剩余体积用无菌蒸馏水补足。所述步骤四中，取扩增产物5μL，与6×Loadingbuffer1.0μL混匀后点于0.75％琼脂糖凝胶上，用1×TAE电泳缓冲液在90V电压恒压电泳30min；取出凝胶，置于紫外灯下观察，并用CAMAG成像系统拍照并保存。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火15s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min；获得扩增产物。其还包括以下步骤：步骤六、如图2、图3所示，对步骤一至步骤五进行耐用性考察，分别考察方法的重复性和DNA聚合酶对该金边土鳖快速鉴别方法的影响，分别取同一批样品重复进行6次试验、更换DNA聚合酶为Taq聚合酶。所述步骤六中，Taq聚合酶PCR体系：50μL体系中含有浓度为10μmol的P3、P4上下游引物各1μL，模板DNA2μL，Taq聚合酶预混体系25μL，剩余体积用无菌蒸馏水补足。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。PCR扩增反应在ABIVeriti梯度PCR仪上进行；PCR完成后，取5μL产物进行电泳检测，电泳条件为电压90V，电泳时间30min。本实施例中的样品来源见表1：表1样品名称来源图2中，Marker为2000bp分子标记，1～38金边土鳖各批样品及伪品，空白为空白对照，聚合酶更换为Taq聚合酶。图3中，Marker为100bp分子标记，1～38金边土鳖各批样品及伪品，空白为空白对照，第20批金边土鳖样品。本实施例中引物为专门设计的特征引物P35'-CTGGCTGAGGGTCG-3'，P45'-ATCTGGGGGGTATG-3'，特征引物位置如图4所示，使用NationalCenterforBiotechnologyInformation网站的Primer-BLAST功能进行查找，未查找出对应的片段，说明该对引物扩增目标的唯一性。结果表明，该方法重复性和对PCR聚合酶适应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种金边土鳖快速鉴别方法，其特征在于：通过针对金边土鳖的特征引物的聚合酶链式反应，对金边土鳖进行快速鉴别。

【技术特征摘要】
1.一种金边土鳖快速鉴别方法，其特征在于：通过针对金边土鳖的特征引物的聚合酶链式反应，对金边土鳖进行快速鉴别。2.根据权利要求1所述的金边土鳖快速鉴别方法，其特征在于，其包括以下步骤：步骤一、将收集的各批供试药材分别取总DNA；步骤二、取特征引物P3，P4加无菌水稀释；步骤三、通过PCR反应程序获得扩增产物；步骤四、扩增产物与6×Loadingbuffer混匀后点于琼脂糖凝胶上，置于紫外灯下观察，拍照并保存；步骤五、照片中显示正品金边土鳖在250bp～500bp之间有一条清晰条带，其他混淆品在该位置均无条带，阴性无干扰。3.根据权利要求2所述的金边土鳖快速鉴别方法，其特征在于，所述步骤一中，将各批供试药材，经75％乙醇擦拭表面，晾干，用研钵研磨成粉末，取研碎后的粉末25mg，用DNeasyBlood&TissueKit提取试剂盒提取试剂盒提取总DNA，备用。4.根据权利要求2所述的金边土鳖快速鉴别方法，其特征在于，所述步骤二中，取特征引物P35'-CTGGCTGAGGGTCG-3'，P45'-ATCTGGGGGGTATG-3'加无菌水稀释成10μmol/μL，备用。5.根据权利要求2所述的金边土鳖快速鉴别方法，其特征在于，所述步骤三中，PCR扩增：50μl体系中含有浓度为10μmol的P3、P4上下游引物各1μL，模板DNA2μL，PrimeSTARHS(Premix)聚合酶预混体系25μL，剩余体积用无菌蒸馏水补足。6.根据权利要求2或4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙冬梅，胥爱丽，毕晓黎，陈昭，李素梅，李养学，江洁怡，陈伟韬，张靖年，
申请(专利权)人：广东省第二中医院广东省中医药工程技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44