一种线粒体脱氢酶法检测重组人肝细胞生长素生物活性的方法技术

一种线粒体脱氢酶法检测重组人肝细胞生长素生物活性的方法，采所用的技术方案是以线粒体脱氢酶活性方法检测ｒｈＨＳＳ产品的生物学活性，提供了一种简便易行、特异敏感的ｒｈＨＳＳ活性检测方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物活性的检测方法，更具体地说是。促进肝细胞再生是防治肝损伤的关键，而肝细胞的再生受多种细胞因子的调控，其中肝细胞生长素(hepatocyte stimulatory substance，HSS)是促进肝细胞增殖、修复肝损伤的一个重要因子。HSS的研究成为近十年肝病防治领域研究的一个热点，已有多家单位研制出了重组人肝细胞生长素(recombinant human hepatocyte stimulatorysubstance，rhHSS)，rhHSS有希望开发成治疗肝病的新生物制品药物。与化学药物不同，蛋白质类药物的药性体现于细胞因子的生物活性，具有生物活性的细胞因子才会有药性，同时生物活性的大小也影响药性的大小，所以细胞因子类药物的活性检测是药物质量控制的重要环节，目前已报道的rhHSS活性检测方法主要包括(1)体内检测方法制作小鼠CCL4肝损伤模型。分组给药后观察动物病死率及肝脏病理改变，需耗时二周时间；(2)体外细胞同位素检测方法制备原代培养的肝细胞或传代HTC(hepatocyte cancer)肝癌细胞，分组加药培养后，加入H3-胸腺嘧啶(H3-TdR)进行液闪计数。上述方法主要存在以下不足(1)体内检测方法操作复杂、结果变异大、耗时长，不宜作为药品活性检测的常规方法；(2)体外细胞同位素检测方法存在放射线污染、变异大等不足，操作也较复杂。本专利技术的目的采所用的技术方案是利用rhHSS对HTC肝癌细胞线粒体脱氢酶活性有促进作用，利用测定HTC肝癌细胞线粒体脱氢酶活性从而测定rhHSS产品的生物活性的方案。即以线粒体脱氢酶活性方法来检测rhHSS产品的生物学活性。本专利技术技术方案的步骤为a复苏冻存的HTC细胞株，接种于培养瓶培养增殖；b以培养液调整培养增殖后HTC细胞浓度，置培养箱培养，如细胞生长状态良好，弃培养液，按如下分组加入供试品(1)HTC细胞对照组(C组)每孔加培养液；(2)阴性对照组(P组)加培养液及rhHSS溶剂或等剂量冻干保护剂；(3)rhHSS组以培养液配置不同浓度rhHSS；置培养箱培养一定时间后，弃上清液，洗涤，加四甲基偶氮唑盐(3-(4，5-dimethylthiazal-2yl)2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)培养充分后吸尽培养液，加有机溶剂，振荡至溶解，用酶标仪测定各孔A值；检测波长570nm，参考波长630nm；数据及统计学处理所有数据以均数±标准差表示，以t检验比较差别的显著性；当样本数n＝8时，t＞2.2有活性。本专利技术技术方案进一步可以为a复苏冻存HTC细胞株，接种于培养瓶培养增殖。b培养增殖后HTC细胞，以含小牛血清DMEM-F12调整细胞浓度，铺96孔板，置37℃，5％CO2培养箱培养，如细胞生长状态良好，弃培养液，按如下分组加入供试品(1)HTC细胞对照组(C组)每孔加无血清的DMEM-F12培养基；(2)阴性对照组(P组)加无血清的DMEM-F12培养基，及rhHSS溶剂或等剂量冻干保护剂；(3)rhHSS组以DMEM-F12培养基配置，终浓度为2.5，10，30μg/ml。每组8孔，置CO2培养箱培养24小时后，弃上清液，洗1次。加MTT，培养5小时后吸尽培养液，加二甲基亚砜，振荡器振荡5-10min，用酶标仪测定各孔A值。检测波长570nm，参考波长630nm。数据及统计学处理所有数据以x±s表示，以t检验比较差别的显著性。当n＝8，t＞2.2时有活性，活性单位＝100×每瓶蛋白质含量(μg)/。本专利技术的检测方法操作简单，无放射性污染，省时，变异小，重复性好，不需特殊仪器设备，克服了现存方法的不足之处。每组8孔，置37℃，5％CO2培养箱培养24小时后，弃上清液，洗1次。加0.15mg/ml MTT 0.1ml/孔，培养5小时后吸尽培养液，加二甲基亚砜0.1ml/孔，振荡器振荡5-10min，用酶标仪测定各孔A值。检测波长570nm，参考波长630nm。实验结果数据及统计学处理所有数据以x±s表示，以t检验比较差别的显著性。表 rhHSS促进HTC肝癌细胞线粒体脱氢酶活性(x±s，n＝8)浓度(μg/ml) A值Control 0.355±0.007rhHSS30 0.402±0.004**10 0.393±0.010**2.5 0.359±0.009与对照组比较，**P＜0.01n＝8，t＞2.2时有活性，活性单位＝100×每瓶蛋白质含量(μg)/＝100×100/(10×0.1)＝10000(单位)权利要求1.，其特征在于步骤为a复苏冻存HTC细胞株，接种于培养瓶培养增殖；b培养增殖后HTC细胞，以培养液调整细胞浓度，置培养箱培养，如细胞生长状态良好，弃培养液，按如下分组加入供试品(1)HTC细胞对照组(C组)每孔加无血清的培养液；(2)阴性对照组(P组)加无血清的培养液，及rhHSS溶剂或等剂量冻干保护剂；(3)rhHSS组以培养液配置系列浓度；置培养箱培养一定时间后，弃上清液，洗涤，加MTT培养充分后吸尽培养液，加有机溶剂，振荡至溶解，用酶标仪测定各孔A值；检测波长570nm，参考波长630nm；对数据及统计学处理所有数据以均数±标准差表示，以t检验比较差别的显著性；当n＝8，t＞2.2时有活性。2.如权利要求1所述的，其特征在于步骤为a复苏冻存HTC细胞株，接种于培养瓶培养增殖；b培养增殖后HTC细胞，以含小牛血清DMEM-F12调整细胞浓度，铺96孔板，置37℃，5％CO2培养箱培养，如细胞生长状态良好，弃培养液，按如下分组加入供试品(4)HTC细胞对照组(C组)每孔加无血清的DMEM-F12培养基；(5)阴性对照组(P组)加无血清的DMEM-F12培养基，及rhHSS溶剂或等剂量冻干保护剂；(6)rhHSS组以DMEM-F12培养基配置系列浓度；每组8孔，置CO2培养箱培养24小时后，弃上清液，洗1次；加MTT，培养5小时后吸尽培养液，加二甲基亚砜，振荡器振荡5-10min，用酶标仪测定各孔A值；检测波长570nm，参考波长630nm；数据及统计学处理所有数据以均数±标准差表示，以t检验比较差别的显著性；当n＝8，t＞2.2时有活性，活性单位＝100×每瓶蛋白质含量(μg)/。3.如权利要求2所述的，其特征在于步骤为复苏冻存HTC细胞株，接种于10ml培养瓶培养增殖，培养增殖后HTC细胞，以含10％小牛血清DMEM-F12调整细胞浓度为1.0×105个细胞/ml，铺96孔板，每孔100μl。置37℃，5％CO2培养箱培养24h，如细胞生长状态良好，弃培养液，按如下分组加入供试品(1)HTC细胞对照组(C组)每孔加100μl无血清的DMEM-F12培养基；(2)阴性对照组(P组)加无血清的DMEM-F12培养基，及rhHSS溶剂或等剂量冻干保护剂；(3)rhHSS组以DMEM-F12培养基配置，终浓度为2.5，10，30μg/ml；每组8孔，置37℃，5％CO2培养箱培养24小时后，弃上清液，洗1次；加0.15mg/ml MTT 0.1ml，培养5小时后吸尽培养液，加二甲基亚砜0.1ml/孔，振荡器振荡5-10min，用酶标仪测定各孔A值；检测波长570n本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种线粒体脱氢酶法检测重组人肝细胞生长素生物活性的方法，其特征在于步骤为：ａ：复苏冻存ＨＴＣ细胞株，接种于培养瓶培养增殖；ｂ：培养增殖后ＨＴＣ细胞，以培养液调整细胞浓度，置培养箱培养，如细胞生长状态良好，弃培养液，按如下分组加入供试 品：（１）ＨＴＣ细胞对照组（Ｃ组）：每孔加无血清的培养液；（２）阴性对照组（Ｐ组）：加无血清的培养液，及ｒｈＨＳＳ溶剂或等剂量冻干保护剂；（３）ｒｈＨＳＳ组：以培养液配置系列浓度；置培养箱培养一定时间后，弃上清液，洗涤，加Ｍ ＴＴ培养充分后吸尽培养液，加有机溶剂，振荡至溶解，用酶标仪测定各孔Ａ值；检测波长５７０ｎｍ，参考波长６３０ｎｍ；对数据及统计学处理：所有数据以均数±标准差表示，以ｔ检验比较差别的显著性；当ｎ＝８，ｔ＞２．２时有活性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：万华印，李茹冰，易学瑞，邹清雁，佟明华，杨联萍，孔祥平，柴向东，王妍，
申请(专利权)人：深圳市海王英特龙生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]