杂交部分控制寡核苷酸及其应用制造技术

本发明专利技术涉及用于通过杂交进行靶核苷酸序列分析的寡核苷酸及该寡核苷酸的应用。该寡核苷酸具有以下通式结构。５′－Ｘ↓［ｐ］－Ｙ↓［ｑ］－Ｚ↓［ｒ］－３’或５′－Ｚ↓［ｒ］－Ｙ↓［ｑ］－Ｘ↓［ｐ］－３′，其中Ｘ↓［ｐ］表示第一杂交部分，该第一杂交部分具有与与其杂交的所述样品核酸中的所述靶核酸序列基本互补的特异性杂交核苷酸序列；Ｙ↓［ｑ］表示含有至少两个通用碱基或非识别碱基类似物的调控子部分；Ｚ↓［ｒ］表示具有预先选定的任意核苷酸序列的第二杂交部分；ｐ，ｑ和ｒ表示核苷酸的数目；Ｘ，Ｙ和Ｚ为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于分析样品核酸中的选定核苷酸序列的核酸杂交领域。更具体地，本专利技术涉及具有新结构的杂交部分控制寡核苷酸及其应用，其中该杂交部分控制寡核苷酸具有产生特异性杂交和检验杂交结果的双重功能。
技术介绍
DNA链与其互补链结合形成双链结构的DNA杂交是分子生物学的基本过程。双链体的形成受离子强度、碱基组成、核酸转化为的片断的长度、错配程度和变性剂的存在影响。原则上，任何核酸—双链DNA、单链DNA、寡核苷酸、mRNA和RNA—可以作为探针。选用哪个作为探针取决于试验的目的。通常，寡核苷酸探针被用于与靶序列形成完美配对的双链体。寡核苷酸杂交试验基于以下通用方案探针或靶序列被标记(如用放射性同位素、荧光染料或反应化合物)，核酸置于杂交条件下进行杂交，去除未杂交的被标记的物质然后定量剩余的标记。提高区分精确双链体和具有一个或多个错配碱基对的双链体的方法在特异性核酸序列确定方面是十分有用的工具，且在临床诊断、遗传研究和法医学实验室分析方面都具有明显的价值。例如，Wallace及其同事证明如单个碱基变化的微小序列差异足以实现短(如14-基体)寡聚物的区分，并且证明了在β-球蛋白基因中的点突变的分子分析中的应用性(Wallace et al.，1981；Conner et al.，1983)。尽管寡核苷酸杂交具有能够正确识别互补链的能力，但是寡核苷酸杂交仍面对限制。含有寡核苷酸的杂交体与长核酸的杂交体比更不稳定。这点在更低的解链温度被反映。杂交体的不稳定性是设计寡核苷酸杂交时被考虑的最重要的因素之一。完美配对的互补和仅一个碱基错配的互补之间的稳定性差异可以是非常小的，相当于它们的Tm(双链解链温度)(duplex melting temperature)0.5℃的小的差异(Tibanyendaet al.，1984；Werntges et al.，1986)。目的寡聚物越短(允许在更复杂的混合物中进行互补链的识别)，单个碱基的错配对整个双链体稳定性的影响就越强。然而，使用如此短的寡聚核苷酸的缺点是即使对于完美互补的序列，它们杂交也较弱，因此必须在降低严格性的条件下被使用。因此，仍需要一种即使在高严格条件下寡核苷酸也更稳定的修饰短寡核苷酸的方法，从而在如此高严格条件下短核苷酸杂交的特异性被提高到足以实现单核苷酸错配的识别。一直有提高寡核苷酸杂交的特异性方面的许多努力。用于高灵敏度杂交的化学修饰DNA碱基方法(Azhikina et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，9011460-11462(1993))和杂交后在低温下长时间进行清洗以提高识别错配的能力的方法(Drmanac et al.，DNA and Cell Biology，9527-534(1990))已经被提出。最近，用于通过人工错配方法提高DNA杂交中单核苷酸多态性(SNPs)的识别的另一种方法已经被介绍(Guo etal.，Nature Biotechnology，15331-5(1997))。此外，包括美国专利号为6,077,668，6,329,144，6,140,054，6,350,580，6,309,824，6,342,355和6,268,128的许多美国专利都公开了用于杂交的探针及该探针的应用。尽管各方法的改进方法不断地被介绍，所有这些涉及寡核苷酸杂交的方法和技术都不能完全地免于寡核苷酸杂交的非特异性所引起的限制和问题。此外，仍然存在如寡核苷酸点样和在基质上的固定及优化杂交条件的建立的失败的人为因素将会影响杂交阴性结果的可能性；尤其错误结果的效果更易于影响高通量筛选方法产生的结果。这种点样和杂交的固有的人为因素是基于寡核苷酸的DNA微阵列中主要的实际缺陷。因而能够使用本身具有检验杂交结果的功能的寡核苷酸在基于寡核苷酸的DNA微阵列方面应该是有益的。贯穿本申请，各种专利和文献被参考并且引用被在括号中提供。这些专利和文献在实体方面的公开内容通过参考由此被包括在本专利技术中以更充分地描述本专利技术和本专利技术所涉及
的阐述。
技术实现思路
在致力于解决此常规探针和杂交方法中存在的问题过程中，本专利技术人已经发展出能够允许具有更高特异性的杂交和其在有关杂交技术的所有领域中的不受限制应用的新寡核苷酸。据此，本专利技术的目的是提供用于通过杂交分析样品核酸中靶核苷酸序列的寡核苷酸。本专利技术的另一目的是提供一种用于通过杂交检测样品核酸中的靶核苷酸序列的存在的方法。本专利技术的再一目的是提供一种用于鉴定样品核酸的靶核苷酸序列中的核苷酸变异的方法。本专利技术的进一步目的是提供用于进行杂交的试剂盒。本专利技术的再一进一步目的是提供用于鉴定样品核酸的靶核苷酸中的核苷酸变异的试剂盒。本专利技术的其它目的和优点通过结合附加权利要求和附图的详细描述将变得明显。附图说明图1为评估该寡核苷酸的杂交特异性的放射自显影照片。在所有板中，野生型等位基因特异性寡核苷酸(泳道1)和突变型等位基因特异性寡核苷酸(泳道2)被固定到尼龙膜上。板A显示试验所用的寡核苷酸被等量地点样于各膜上。B板中，显示突变型基因组DNA片断的第一杂交的结果。板C显示用于证实第一杂交结果的第二杂交的结果。图2为显示使用本寡核苷酸的野生型基因组DNA片断的杂交反应的结果。野生型等位基因特异性寡核苷酸(泳道1)、突变型等位基因特异性寡核苷酸(泳道2)和阴性对照寡核苷酸(泳道3)被固定到尼龙膜上。在板B中，显示野生型基因组DNA片断的第一杂交的结果。板C表示用于证实第一杂交的结果的第二杂交的结果。图3为表示使用本寡核苷酸的突变型基因组DNA片断的杂交反应的结果的放射性自显影照片。泳道和板的说明与图2相同。图4为显示使用本寡核苷酸进行杂合型基因组DNA片断的杂交反应的结果的放射自显影照片。泳道和板的说明与图2相同。具体实施例方式本专利技术总体地涉及具有产生特异性杂交和定量地核实杂交结果的双重功能的寡核苷酸。本专利技术的寡核苷酸被命名为杂交部分控制寡核苷酸(下文称为“HPC寡核苷酸”)，该寡核苷酸能够确保与靶核苷酸序列的非常特异性的杂交反应，因此使用杂交的各种分析能够以更高的可信度被进行。HPC寡核苷酸的原理是基于它的新结构，该结构具有(i)具有与靶核苷酸序列基本互补的核苷酸序列的第一杂交部分，(ii)具有预先选定的任意核苷酸序列的第二杂交部分，(iii)含有位于第一杂交部分和第二杂交部分之间的至少两个通用碱基和非识别碱基类似物的调控子部分。本HPC寡核苷酸允许第一和第二杂交部分分别参与到作为第一杂交和第二杂交的两个独立的杂交中。HPC寡核苷酸中通用碱基或非识别碱基残基基团的出现使在第一杂交中仅第一杂交部分被与靶核苷酸序列杂交。此外，第二杂交部分用作定量检验第一杂交反应结果的第二杂交的通用杂交位点。因而，只是使用该双重功能的HPC寡核苷酸，与靶核苷酸序列的特异性杂交和第一杂交结果的定量检验就能被完成。因为这些原因，本专利技术的HPL寡核苷酸就在一定严格条件下提高寡核苷酸杂交的特异性和定量检验杂交结果的方式而言，基本上不同于常规寡核苷酸。本专利技术的HPC寡核苷酸是显著有效的并可在基于核酸杂交的应用方面广泛应用。此外，常规寡核苷酸中与杂交特异性相关的各种问题可以通过本专利技术的HPC寡核苷酸被基本地解决。本HPC寡核苷酸的特征和优点总结如本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于通过杂交进行样品核酸中的靶核苷酸序列分析的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有以下通式结构：５’－Ｘ↓［ｐ］－Ｙ↓［ｑ］－Ｚ↓［ｒ］－３’或５’－Ｚ↓［ｒ］－Ｙ↓［ｑ］－Ｘ↓［ｐ］－３’其中Ｘ↓［ｐ］表示具有与与其杂交的所述样品核 酸中的所述靶核苷酸序列基本互补的特异性杂交核苷酸序列的第一杂交部分；Ｙ↓［ｑ］表示含有至少两个通用碱基或非识别碱基类似物的调控子部分；Ｚ↓［ｒ］表示具有预先选定的任意核苷酸序列的第二杂交部分；ｐ，ｑ和ｒ表示核苷酸的数目；Ｘ，Ｙ和Ｚ为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：千钟润，
申请(专利权)人：视基因公司，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]