抗ROR1抗体制造技术

本发明专利技术涉及抗体，并且具体地说，涉及对受体酪氨酸激酶样孤儿受体(Receptor tyrosine kinase‑like Orphan Receptor，ROR)展现特异性的抗体，以及其例如用于治疗癌症的用途。本发明专利技术延伸到编码抗体的多核苷酸和多肽序列，以及其治疗用途，以及包含这些分子的诊断试剂盒。本发明专利技术还延伸到抗体‑药物结合物和其在疗法中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗ROR1抗体相关申请的交叉引用依据35U.S.C.§119(e)本申请要求2015年7月16日提交的美国临时申请第62/193,237号和2015年5月18日提交的美国临时申请第62/163,241号的权益，每个临时申请都以全文引用的方式并入本文中。关于序列表的声明以文本格式代替纸本拷贝来提供与本申请相关的序列表，并且在此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是FIVE_004_02WO_ST25.txt。文本文件是185KB，创建于2016年5月17日，并经由EFS网电子提交，同时进行说明书的编档。
本专利技术涉及抗体，并且具体地说，涉及对受体酪氨酸激酶样孤儿受体(Receptortyrosinekinase-likeOrphanReceptor，ROR)展现特异性的抗体，以及其例如用于治疗癌症的用途。本专利技术延伸到编码抗体的多核苷酸和多肽序列，以及包含这些分子的组合物，以及其治疗用途。还描述了包含这些分子的诊断试剂盒和方法。本专利技术还延伸到抗体-药物结合物和其在疗法中的用途。
技术介绍
受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)属于保守的受体酪氨酸激酶家族，其由两个家族成员ROR1和ROR2组成，所述两个家族成员是I型跨膜受体酪氨酸激酶。ROR1和ROR2的细胞外域含有免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)结构域、富含半胱氨酸结构域(cysteine-richdomain，CRD)(又称为卷曲(Frizzled，Fz)结构域)和三环(Kringle，Kr)结构域。所有三个结构域都与蛋白质-蛋白质相互作用有关。在细胞内，ROR1和ROR2具有酪氨酸激酶(TK)结构域和富含脯氨酸结构域(PRD)，两个富含丝氨酸/苏氨酸结构域横跨前述结构域。此家族的细胞功能是调节包括骨骼和神经元发育在内的发育过程中的细胞迁移、平面细胞极性(planarcellpolarity，PCP)和顶端-基底细胞极性以及轴突生长。Wnt5a是在癌发生中具有关键作用的糖蛋白，已经确定其通过结合和活化ROR1和ROR2来调节这些功能(西谷(Nishita)等人,2010,《细胞生物学趋势(TrendsCellBiol.)》20(6):346-54)。Wnt5a结合于ROR2和其辅助受体卷曲结构域可以活化INK通路和细丝蛋白A，以调节细胞迁移和侵袭，使Racl和RhoA调节细胞极性，并诱发Src家族成员调控例如MMP1、2、13等基质金属蛋白酶的表达，并抑制典型Wnt通路。不同于ROR2，调节ROR1细胞功能背后的分子机制仍然不清楚。近期研究表明当与Wnt5a共表达时ROR1可能通过NF-B促进细胞增殖(福田(Fukuda)等人,2008,《美国国家科学院院刊(ProcNatl.AcadSciUSA.)》105(8):3047-52)。ROR蛋白是胚胎蛋白。在小鼠中，其仅仅在发育阶段期间表达。ROR表达在出生后迅速沉默，并且在成人组织中无法检测到。ROR1或ROR2敲除的小鼠展现新生致死现象并且在出生后不久死亡。ROR1敲除的小鼠正常发育，并且未展示可见表型。ROR2敲除的小鼠表现出骨骼缺陷，例如口鼻、肢体、尾巴缩短和腭裂，以及心室间隔的膜部分缺陷。ROR1在B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-cellchroniclymphocyticleukemia，CLL)和套细胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma，MCL)中异常表达。像小鼠对应部分一样，除脂肪组织中的低水平以外，无法在正常血细胞和其它成人组织中检测到人类ROR1表达。研究已经证明ROR1和纤维调节素的敲低引起CLL细胞的细胞凋亡显著增加(乔杜里(Choudhury)等人,2010,《英国血液学杂志(BrJHaematol.)》151(4):327-35)。CLL是西半球最常见的人类白血病形式。根据白血病与淋巴瘤协会，每年美国诊断出约16,000例新的CLL病例，并且每年4,400人死于此病。CLL的特征在于功能性不成熟的细胞累积在骨髓、血液、淋巴组织和其它器官中。它是成熟B细胞的恶性病，并且最常影响55岁以上的成年人，其中三分之二是男性，不过有时发生在青年人中。对新颖并改善的CLL治疗选择存在显著未满足的医疗需求。尽管使用化学疗法和干细胞移植进行治疗，但是CLL是一种无法治愈的疾病，平均五年存活率只有50％。已经报告，在统计显著性下，神经母细胞瘤患者中高水平的ROR1和ROR2表达与较低存活率相关(图1和2)。来自前BALL患者的基因表达谱分析数据还表明ROR1上调与t(1；19)易位之间的相关性，此产生E2A-PBX1融合蛋白并充当前B-ALL的亚型的生物标记物(图3)。近期用于肿瘤适应症的单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)的进展产生了治疗CLL的新选择，作为独立疗法或与化学疗法方案组合。2007年，坎帕斯(Campath，抗CD52人源化抗体)经FDA批准作为CLL的一线治疗。先前，坎帕斯经批准作为对烷基化剂和福达华(Fludara)停止回应的CLL患者的二线治疗。与使用苯丁酸氮芥(chlorambucil)作为初始治疗相比，坎帕斯治疗展示显著优良的患者反应。坎帕斯还展示有利的毒性特征。美罗华(Rituxan)是一种抗CD20抗体药物，经FDA批准用于与两种其它化学疗法药物氟达拉宾(fludarabine)和环磷酰胺(cyclophosphamide)组合治疗CLL患者。在所有这些进展下，约20％的患者仍然未实现完全的疾病控制，并且大部分患者最终对可用疗法发展抗性。因此，仍然极大地需要更有效和创新的CLL疗法。附图说明为更好地了解本专利技术和展示其实施例如何实现，现将通过实例参考随附图式。图1是展示具有高水平ROR1基因表达的神经母细胞瘤患者统计学上显著较低的存活的图。图2是展示具有高水平ROR2基因表达的神经母细胞瘤患者统计学上显著较低的存活的图。图3展示前BALL患者中的ROR1mRNA表达。图4表示ROR1噬菌体展示淘选策略。图5是展示ROR1噬菌体抗体ELISA结果的一实例的图。图6是展示ROR1噬菌体抗体细胞ELISA结果的一实例的图。图7说明通过噬菌体竞争ELISA进行的亲和力评级的方法。图8说明表位I类抗体CDR序列分析。图9说明表位II类抗体CDR序列分析。图10说明表位III类抗体CDR序列分析。图11说明表位IV类抗体CDR序列分析。图12是展示通过ELISA，ROR1阳性噬菌体克隆的结合特异性的一实例的图。图13是展示通过ELISA，阳性噬菌体克隆结合于人类ROR1与人类ROR2的一实例的图。图14a和14b是人类抗ROR1全长IgG1抗体表达载体的质粒图谱。图15展示本专利技术的抗ROR1全长IgG1抗体的一实施例的人类抗体恒定域的蛋白质序列。图16说明纯化人类抗ROR1全长IgG1抗体的SDS-PAGE。图17a和17b展示通过生物膜层干涉技术，抗ROR1全长IgG1抗体的Kd结合亲和力分析。图18A和18B表示抗体601-3-2表位定位ELISA数据。突出显示区说明人类ROR1蛋白序列中的601-3-2表位。图19A和19B表示抗体601-3-12表位定位ELISA数据。突出显示区说明人类ROR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的人类抗受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)抗体或其功能片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.18 US 62/163,241;2015.07.16 US 62/193,2371.一种分离的人类抗受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)抗体或其功能片段。2.根据权利要求1所述的分离抗体或其功能片段，其中所述功能片段包含选自由以下组成的群组的片段：VH、VL、Fd、Fv、Fab、Fab'、scFv、F(ab')2和Fc片段。3.根据权利要求1所述的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段以约10-5到10-13M-1，优选10-6到10-9M-1，甚至更优选10-10到10-12M-1的亲和力常数与ROR1肽选择性地相互作用。4.根据权利要求1所述的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体或其片段展现针对ROR1的约10-7到10-10M-1的IC50。5.根据权利要求1所述的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体或其片段能够介导表达ROR1的肿瘤细胞的杀死。6.根据权利要求1所述的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体或其片段能够阻断Wnt5a与ROR1蛋白的结合。7.根据权利要求1所述的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体或其片段能够阻断Wnt5aROR1磷酸化。8.根据权利要求1所述的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体或其片段能够抑制癌细胞增殖。9.根据权利要求1所述的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体其片段能够在结合于ROR1时被内吞。10.根据权利要求1所述的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体或其片段能够结合于ROR1蛋白上的表位I到IV中的一个或多个，其中表位I包含残基KNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSR(SEQIDNO:237)和AANCIRIGIPMADPI(SEQIDNO:238)，表位II包含残基SSTGVLFVKFGPPPTASPG(SEQIDNO:239)和SNPMILMRLKLPNCE(SEQIDNO:240)，并且表位III和表位IV包含SEQIDNO:2的细胞外序列的其余部分，或这些表位中任一表位的功能片段或变异体。11.根据权利要求1所述的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段包含至少一个包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的抗原结合区：(i)SEQIDNO:8、9、10、16、17和/或18；(ii)SEQIDNO:24、25、26、32、33和/或34；(iii)SEQIDNO:40、41、42、48、49和/或50；(iv)SEQIDNO:56、57、58、64、65和/或66；(v)SEQIDNO:72、73、74、80、81和/或82；(vi)SEQIDNO:88、89、90、96、97和/或98；(vii)SEQIDNO:104、105、106、112、113和/或114；(viii)SEQIDNO:120、121、122、128、129和/或130；(ix)SEQIDNO:136、137、138、144、145和/或146；(x)SEQIDNO:152、153、154、160、161和/或162；(xi)SEQIDNO:168、169、170、176、177和/或178；(xii)SEQIDNO:184、185、186、192、193和/或194；(xiii)SEQIDNO:200、201、202、208、209和/或210；和/或(xiv)SEQIDNO:216、217、218、224、225和/或226。12.根据权利要求1所述的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段包含至少一个由选自由以下组成的群组的核苷酸序列编码的抗原结合区：(i)SEQIDNO:5、6、7、13、14和/或15；(ii)SEQIDNO:21、22、23、29、30和/或31；(iii)SEQIDNO:37、38、39、45、46和/或47；(iv)SEQIDNO:53、54、55、61、62和/或63；(v)SEQIDNO:69、70、71、77、78和/或79；(vi)SEQIDNO:85、86、87、93、94和/或95；(vii)SEQIDNO:101、102、103、109、110和/或111；(viii)SEQIDNO:117、118、119、125、126和/或127；(ix)SEQIDNO:133、134、135、141、142和/或143；(x)SEQIDNO:149、150、151、157、158和/或159；(xi)SEQIDNO:165、166、167、173、174和/或175；(xii)SEQIDNO:181、182、183、189、190和/或191；(xiii)SEQIDNO:197、198、199、205、206和/或207；和/或(xiv)SEQIDNO:213、214、215、221、222和/或223。13.根据权利要求12所述的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体或功能片段包含至少两个、三个、四个、五个或六个在(i)到(xiv)任一个中定义的抗原结合区。14.根据权利要求1所述的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段包含轻链可变区(VL)和/或重链可变区(VH)，所述轻链可变区包含基本上如SEQIDNO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196或212中阐述的氨基酸序列或者其功能片段或变异体，所述重链可变区包含基本上如SEQIDNO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204或220中阐述的氨基酸序列或者其功能片段或变异体。15.根据权利要求1所述的分离抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段包含轻链可变区(VL)和/或重链可变区(VH)，所述轻链可变区由包含基本上如SEQIDNO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195或211中阐述的核苷酸序列或者其功能片段或变异体的多核苷酸编码，所述重链可变区由包含基本上如SEQIDNO:11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203或219中阐述的核苷酸序列或者其功能片段或变异体的多核苷酸编码。16.一种分离抗体，其与根据权利要求1到15所述的任一抗体竞争结合于ROR1。17.一种分离肽，其能够结合于受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)蛋白，所述肽包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：(i)SEQIDNO:8、9、10、16、17和/或18；(ii)SEQIDNO:24、25、26、32、33和/或34；(iii)SEQIDNO:40、41、42、48、49和/或50；(iv)SEQIDNO:56、57、58、64、65和/或66；(v)SEQIDNO:72、73、74、80、81和/或82；(vi)SEQIDNO:88、89、90、96、97和/或98；(vii)SEQIDNO:104、105、106、112、113和/或114；(viii)SEQIDNO:120、121、122、128、129和/或130；(ix)SEQIDNO:136、137、138、144、145和/或146；(x)SEQIDNO:152、153、154、160、161和/或162；(xi)SEQIDNO:168、169、170、176、177和/或178；(xii)SEQIDNO:184、185、186、192、193和/或194；(xiii)SEQIDNO:200、201、202、208、209和/或210；和/或(xiv)SEQIDNO:216、217、218、...

【专利技术属性】
技术研发人员：布莱恩·黄，艾玛·曼斯特勒，刘诚，许奕阳，刘宏，言甦，向京宜，王培，
申请(专利权)人：戊瑞治疗有限公司，优瑞科生物技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US