用于治疗性寡核苷酸的蛋白质载体系统技术方案

用通过柔性接头分子相连的反应性化学基团修饰治疗性寡核苷酸，包括反义寡核苷酸和ｓｉＲＮＡ。经过修饰的寡核苷酸能够与移动蛋白特别是人血清清蛋白形成共价键。与末经修饰的寡核苷酸相比，由此生成的复合物在保留生物学活性的同时，还具有增强的细胞进入、显著增加的血清半衰期、和降低的免疫系统刺激。经修饰寡核苷酸克服了与当前反义药物有关的许多问题。本发明专利技术的经修饰寡核苷酸作为治疗剂施用，并且与所针对的ＲＮＡ分子内的互补序列杂交。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在与移动蛋白形成共价键后展示增强的细胞进入和延长的治疗半衰期的经修饰治疗性寡核苷酸，包括反义寡核苷酸(下文称作“ASO”)、核酶、和小型干涉RNA(下文称作“siRNA”)。更具体的说，本专利技术涉及经过能够在体内或离体与人移动蛋白形成特异共价连接的化学反应性基团修饰的治疗性寡核苷酸。另外，本专利技术提供了将治疗性寡核苷酸导入细胞的方法，以及使用它们来治疗疾病状况的方法。
技术介绍
治疗性寡核苷酸治疗性寡核苷酸，诸如ASO和siRNA，是设计与靶DNA或RNA上特异序列杂交从而防止基因表达(特别是有助于疾病或紊乱发展的基因)的单链或双链DNA或RNA短片段(如长度为大约7个-大约45个序列特异碱基)。ASO有许多属性从治疗立场看是吸引人的，包括ASO的特异性、预先筛选ASO对非靶杂交的能力、以及ASO作为已知疾病的特异治疗处理的迅速开发(Tanaka等人，Respir Res.，25-9，2001)。由这种方法提供的简单性和特异性使得利用治疗性寡核苷酸诸如ASO成为治疗或预防疾病或紊乱的基于小分子或蛋白质的传统疗法的有吸引力的替代方法。具体而言，反义方法可能是利用大量可获得的来自人和病原体来源的基因组和cDNA序列数据来开发治疗剂的最快方式。不过，在将ASO开发成可广泛应用的治疗剂的过程中遭遇到几个基本障碍。一个众所周知的问题是未经修饰的ASO被细胞和胞外核酸酶快速降解(Zelphati，O.等人，Res.Dev.，3323-338，1993；Thierry，A.R.等人，在《Gene RegulationBiology of Antisense RNAand DNA》(《基因调控反义RNA和DNA的生物学》)中，Raven出版社，纽约，第147-161页，1992)。对磷酸二酯主链的修饰，例如将硫代磷酸酯连接引入DNA主链，降低了ASO对降解的敏感性并将血液半衰期由数分钟延长至数小时。然而，从治疗的观点看这样的半衰期仍然不能令人满意。第二个问题是ASO到达靶mRNA的胞内投递效率低下。造成投递效率低下的因素包括蛋白质结合，主要是和血清清蛋白；寡核苷酸的快速代谢；以及穿过细胞膜到达胞内和/或核内靶的能力有限。这些因素又主要归咎于ASO上的负电荷。第三个问题是ASO对免疫系统刺激，它可能导致治疗并发症。这种免疫系统刺激可能与系统毒性有关，诸如由补体介导的过敏症、改变的凝血特性、和血细胞减少症(Galbraith等人，Antisense Nucl.AcidDrug Des.，4201-206，1994)。通常，由于ASO的快速清除和低效投递，为了获得功效需要大量且频繁的给药，而这进一步促进了免疫系统刺激。核酶是有潜力作为治疗剂的另一种形式的治疗性寡核苷酸。核酶是具有催化活性而能够特异切割其它RNA分子的核糖核酸。核酶在用于本文时不受大小限制，而且可以包括长度超过45个碱基的RNA序列。核酶在发挥功能时，通过Watson-Crick碱基配对而结合底物RNA序列，随后切割底物序列的磷酸二酯主链和失活(Bunnell，B.A.等人，Clin.Micro.Rev.，1142-56，1998；Jen，K-Y.等人，Stem Cells，18307-319，2000)。在核酶作为治疗剂时发现的一个限制是它们对RNA酶降解的易感性。因此，保护核酶免于RNA降解同时保留核酶生物学活性的方法对于疾病治疗是有用的(Bunnell，B.A.等人，Clin.Micro.Rev.，1142-56，1998)。载体蛋白缀合物移动蛋白诸如血液蛋白作为治疗剂载体分子的使用在本领域是广为人知的。在许多研究中，用反应性基团修饰肽和小分子药物使之能够缀合蛋白质。本专利技术的移动蛋白包括但不限于血清清蛋白、球蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白、铁蛋白、诸如此类。与移动蛋白缀合的分子可以保留它们最初的治疗活性，同时展示显著延长的半衰期和改进的生物利用率。缀合可以是非特异的(如使用与移动蛋白中可利用氨基反应的N-羟基琥珀酰亚胺)或特异的(如使用与清蛋白中单一游离硫醇基反应的马来酰亚胺基(参阅例如美国专利号6,329,336))。已经在体内或离体实现了缀合，尽管体内缀合可能具有某些优点。这些缀合物的典型应用集中于胞外或细胞表面目标。因此，这些应用中的缀合治疗剂不必穿过细胞膜。尚不清楚这种方法能否用于胞内目标。本领域需要易于穿过细胞膜并将活性治疗剂诸如ASO、siRNA、和核酶投递至胞内目标诸如RNA或DNA靶的治疗性化合物。本专利技术通过提供胞内投递活性治疗性寡核苷酸同时还保留延长的系统半衰期的新型治疗性化合物而满足了本领域的这些和更多需要。本专利技术还提供了使用本专利技术的治疗性寡核苷酸化合物来治疗疾病和/或紊乱的方法。专利技术概述本专利技术包括合在一起使得能够使用治疗性寡核苷酸的新型化学反应性衍生物的化合物、手段和方法，所述治疗性寡核苷酸衍生物能够与移动蛋白(包括移动血液蛋白)上可利用的官能团反应而形成共价连接。本专利技术还提供了使用具有反应性基团的治疗性寡核苷酸衍生物增强细胞进入、抵抗核酸酶降解并改进体内半衰期、以及选择性阻断特定基因的表达的方法。在一个实施方案中，本专利技术涵盖包含通过接头分子与ASO缀合的化学反应性基团的ASO新型化学反应性衍生物。这些经修饰ASO能够与移动蛋白特别是人血清清蛋白上的氨基、羟基、或硫醇基反应而形成稳定的共价键。在另一个实施方案中，本专利技术涵盖包含通过接头分子与siRNA缀合的化学反应性基团的siRNA新型化学反应性衍生物。这些经修饰siRNA能够与移动蛋白特别是人血清清蛋白上的氨基、羟基、或硫醇基反应而形成稳定的共价键。在另一个实施方案中，本专利技术涵盖包含通过接头分子与核酶缀合的化学反应性基团的核酸新型化学反应性衍生物。这些经修饰核酶能够与移动蛋白特别是人血清清蛋白上的氨基、羟基、或硫醇基反应而形成稳定的共价键。本专利技术提供了使用包含经修饰治疗性寡核苷酸的化合物来增强细胞进入和提高半衰期的方法，包括以下步骤a)将化合物(在体内或离体)与含有内源血液或组织液或者重组移动蛋白的生物学样品混合；b)与生物学样品中存在的移动蛋白缀合；c)摄取缀合物进入细胞并使治疗性寡核苷酸结合胞内和核内目标；并d)选择性地阻断特定基因的表达。本专利技术还提供了使用本专利技术的治疗性寡核苷酸及其衍生物来治疗疾病的方法，包括以下步骤a)将化合物(在体内或离体)与含有内源血液或组织液或者重组移动蛋白的生物学样品混合；b)缀合生物学样品中存在的移动蛋白；c)摄取缀合物进入细胞并使治疗性寡核苷酸结合胞内和核内目标；并d)选择性地阻断特定基因的表达。附图简述附图说明图1显示了包含5′-(BMPS)(C6NH)接头和马来酰亚胺反应性部分的ASO的一般结构。BMPS指N-(β-马来酰亚胺基丙基氧基)琥珀酰亚胺酯。图2显示了可用于缀合至siRNA双链体的N3_9S-MPA接头的结构。实施方案详述定义在用于本文时，“寡核苷酸”指能够结合互补单链或双链RNA或DNA靶序列的单链或双链RNA或DNA，包括ASO和siRNA。作为本专利技术ASO或siRNA的治疗性寡核苷酸中的序列特异性片段包含长度为大约7个碱基-大约45个碱基的核苷酸序列。寡核苷酸中还可以包含非序列特异的额外碱基，诸如例如接本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过对有需要的患者施用治疗性寡核苷酸来治疗疾病的方法，包括对患者施用包含反应性基团的治疗性寡核苷酸，反应性基团通过与移动蛋白的反应而形成共价键，以此将所述移动蛋白与所述治疗性寡核苷酸缀合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢东，
申请(专利权)人：医桥公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]