校准试剂及其用途制造技术

本发明专利技术提供了校准试剂及其用途，所述标准试剂包含通过接头与蛋白质载体缀合的肽，其中所述肽包含目的表位。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】校准试剂及其用途在近年内开发和建立了反相蛋白质阵列(RPA)作为用于分析在微量生物学样品(例如细胞裂解物、组织裂解物或体液)中代表不同信号转导级联的关键分析物的聚焦的蛋白质组的便利方法。蛋白质表达的相对差异不仅代表特定关键蛋白质的丰度，而且代表这些关键蛋白质的活化的、翻译后修饰(例如磷酸化)形式，其可描述和分类例如对细胞培养物施加的药物化合物的特定处理效果，例如候选药物对激酶的抑制作用，或描述和分类不同疾病状态，例如肿瘤在其不同进展状态中的亚型。RPA可进行多个平行样品的比较测量，例如来自不同处理的细胞培养物的样品或来自不同疾病群体的样品。在不同样品组群中发现的蛋白质表达或蛋白质活化模式的显著改变将有助于例如鉴定最有效的候选药物，阐明处理诱发的作用模式方案，或发现新的诊断/预后疾病标记物。 免疫亲和测定，例如在反相蛋白质阵列(RPA)中使用的免疫亲和测定是基于亲和试剂和目的蛋白质之间的特异性相互作用。所述测定包括在阵列上固定生物学样品，形成样品点。将固定了样品的阵列与亲和试剂(即抗体)孵育，并通过产生的检测信号，例如发光信号测量随后形成的亲和试剂和目的蛋白质的复合物。使用分析物特异性亲和试剂对每个阵列染色，所述亲和试剂可被标记或与第二检测试剂孵育。通过多种手段(色度、荧光、化学发光等)检测形成的复合物。一般RPA测量不同样品之间的表达或活化信号的相对变化。样品的定量分析需要使用校准试剂。目前用于蛋白质分析物的校准试剂是与分析物具有相同氨基序列的重组蛋白质。例如，专利申请W02007/048436A1描述了用于反相蛋白质微阵列的校准曲线，其中对包含BSA或大鼠血清的点样缓冲液加入不同浓度的纯化目的蛋白质(Akt)。然而，产生呈现正确表位的重组蛋白质是费时的，且经常不成功。特别是对磷酸化的表位，目前没有可用的可靠校准试剂。因此，需要设计提供具一般适用性的、对不同目的分析物表位具有可选择的特异性的试剂。所述试剂将允许校准例如在分隔的时间、由不同的实验室人员、在不同的设备或在不同的印记循环(print run)中构建的阵列上进行的实验结果。此外,可最佳地预定义由各个亲和试剂产生的蛋白质特异性RPA信号的线性范围。因此，本专利技术提供了包含通过接头与蛋白质载体连接的肽的校准试剂，其中所述肽包含目的表位。优选地，所述目的表位是磷酸化的。使用此校准试剂，可利用RPA或另一种亲和测定产生用于定量蛋白质的可靠的标准曲线。通常使用机器人微阵列点样仪(microarrayer )通过将小样品体积的例如细胞或组织裂解液沉积在高度结合性的基质表面上构建RPA。在基质上的每个裂解物点包含细胞蛋白质和分析物的全部成分(complement)。可在一个微阵列上平行点样数百个样品，以允许在同一测定中的样品的高通量交叉比较。因为每个点消耗的样品体积极低，可以从相同的最初体积的样品材料中容易地产生包含相同样品组的重复阵列。本专利技术的校准试剂对定量包含磷酸化的目的表位的蛋白质特别有效。术语“目的表位”指被目的亲和试剂识别的多肽部分。目的亲和试剂优选地对目的表位是特异性的。如本文使用的术语“表位肽”指包含目的表位的肽。表位肽优选地为12至25个氨基酸之间的长度。更优选地，肽的长度是12至20，更优选地14至17个氨基酸的长度。目的表位可被修饰，例如磷酸化。本文中使用的术语“磷酸化的表位”指包含至少一个具有磷酸基的氨基酸的表位。优选地，目的表位包含I至5个磷酸化氨基酸。优选地，修饰的氨基酸的位置大约在表位肽的中间。例如在15个氨基酸长度的肽中，修饰的氨基酸优选地在第7、8和/或9位(见图2C)。修饰氨基酸(例如磷酸化)的方法是本领域技术人员熟知的。表位肽通过接头(见附图说明图1A)与蛋白质载体共价结合，其中所述表位肽与接头共价结合，接头与蛋白质载体共价结合。在一个优选的实施方案中，结合与BSA的游离的N-端半胱氨酸(Cys)基团共价结合，其中游离的Cys基团是未参与二硫键的半胱氨酸残基。表位妝可基本在两步中与蛋白质载体连接步骤I)接头与表位肽缀合，其中所述接头优选用标签标记。接头可与肽的N-或C-端连接。优选地，接头与肽的N-端连接。步骤2)接头的游离端与蛋白质载体缀合。接头或间隔区是包含2至10，优选2至5，更优选3至4个天然或非天然氨基酸的肽。天然氨基酸是天然存在的氨基酸，例如特别是丙氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸。非天然氨基酸是不天然存在的氨基酸。非天然氨基酸的实例是8-氨基-3,6-二氧辛酸(dioxa-octanoic acid) (Doa)和氨基氧乙酸。接头是亲水，且可仅包含天然氨基酸，或仅包含非天然氨基酸，或包含天然和非天然氨基酸二者的混合物。优选地，接头包含一个或多个以下天然氨基酸半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。接头也优选包含一个或多个Doa。更优选地，接头是半胱氨酸-Doa-Doa。优选地,用Dabsyl (丹磺酰)标记接头。产生具有特定氨基酸序列的肽的方法是本领域技术人员熟知的。合适的方法是，例如在 Merrifield, Science 1986, 232:341-347 (方法)和 Carpino 等人，J.Am. Chem. 1990，112:9651-52 (试剂)中描述的固相合成。蛋白质载体是非特异地结合至表面的蛋白质。优选地，蛋白质载体是至少20kDa的蛋白质，并与在亲和测定中使用的亲和试剂不显示或显示很低的交叉反应性。蛋白质载体优选地是白蛋白，更优选地血清白蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白。优选的血清白蛋白是BSA。“目的亲和试剂”是识别并结合目的表位的试剂。优选地，目的亲和试剂对目的表位是特异性和选择性的。亲和试剂可为抗体、适体或设计的锚蛋白重复蛋白质(DARPin)。优选地，亲和试剂是抗体。“目的抗体”可为任意抗体。优选地，所述抗体是IgG抗体，更优选是单克隆抗体。目的抗体包括但不限于人源化抗体和啮齿类抗体。啮齿类抗体包括但不限于小鼠、兔和大鼠抗体。优选地，抗体是兔单克隆抗体。“目的适体”是长15至60碱基的单链RNA或DNA寡核苷酸，其以高亲和力结合目的表位。“设计的锚蛋白重复蛋白质”或称“DARPin”是包含至少一个锚蛋白重复的结合分子。锚蛋白重复是蛋白质中的一个基序，由2个通过环分隔的α螺旋组成，其可被选择用于特异性识别多种靶蛋白。锚蛋白重复的一般长度是33个氨基酸。不像抗体，锚蛋白重复不包含任何二硫键且在所有细胞区室中存在。此外，本专利技术提供了如上所述的校准试剂在产生标准曲线中的用途。本专利技术提供了产生标准曲线的方法，其包括以下步骤a)在阵列上固定2个或多个浓度的上述校准试剂，b)用可检测的目的亲和试剂孵育所述阵列，c)对2个或多个浓度的校准试剂的每个浓度测量结合的亲和试剂的信号强度，和d)将信号强度和目的表位的量相关联。标准或校准曲线是定量研究工具，将测定数据作图的方法，用于测定物质的浓度，即目的表位的浓度。 术语“结合的亲和试剂”指与包含目的表位的蛋白质或肽形成复合物的亲和试剂。通过多种手段例如色度、荧光或化学发光检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.11.16 EP 09176130.41.校准试剂，其包含通过接头与蛋白质载体连接的肽，其中所述肽包含目的表位。2.根据权利要求I的校准试剂，其中所述目的表位包含至少一个磷酸化氨基酸。3.根据权利要求I或2的 校准试剂，其中所述肽的长度为12至25个氨基酸。4.根据权利要求I至3中任一项的校准试剂，其中所述蛋白质载体是牛血清白蛋白(BSA)05.根据权利要求I至4中任一项的校准试剂，其中所述接头包含半胱氨酸和8-氨基-3，6- 二氧辛酸(8-amino-3, 6-Dioxaoctanoic acid)。6.权利要求I至5中任一项的校准试剂，其中所述肽蛋白质载体比例在O.3和I之间7.产生标准曲线的方法，其包括以下步骤 a)在阵列上固定2个或多个浓度的根据权利要求I至6中任一项的校准试剂， b)孵育所述阵列和可检测的目的亲和试剂， c)对2个或多个浓度的所述校准试剂的每种浓度测量结合的亲和试剂的信号强度，和 d)关联信号强度和目的表位的量。8.定量样品中包含目的表位的蛋白质的浓度的方法，其包括 a)在阵列上固定 i)2个或多个浓度的根据权利要求I至6中任一项的校准试剂，和 ii)I个或多个生物学样品， b)孵育所述阵列和可检测的目的亲和试剂， c)对2个或多个浓度的所述校准试剂中的每种浓度和I个或多个生物学样品中的每一种测量结合的亲和试剂的信号强度， d)关联信号强度和目的表位的量，和 e)定量I个或多个生物学样品中的包含目的表位的蛋白质。9.测定目的亲和试剂的检测下限的方法，其包括 a)在阵列上固定2个或多个浓度的根据权利要求I至6中任一项的校准试剂， b)孵育所述阵列和可检测的目的亲和试剂， c)对2个或多个浓度的所述校准试剂中的每种浓度测量结合的亲和试剂的信号强...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·阿萨迪格尔，E·诺戈采克，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：