可转导的DNA结合蛋白制造技术

本发明专利技术揭示了一种嵌合蛋白，其包括：ａ）多个锌指结构域；及ｂ）一个异源蛋白质转导结构域，有效地将所述蛋白质转移穿过细胞膜。所述嵌合蛋白可被有效地转导进培养的真核细胞中，在其中调节特异性靶基因。因此，人工转录因子包括ＰＴＤ可用于产生调节内源基因的蛋白质药物及改变细胞在体外和体内行为的蛋白质药物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉参考本申请要求申请日为2003年6月10日的U.S.S.N.60/477,459的优先权，该申请的全文内容并入本文参考。
技术介绍
本专利技术涉及DNA结合蛋白。结合DNA的许多转录因子具有包括一个DNA结合结构域和一个效应子结构域的模块结构。有许多类型的DNA结合结构域。锌指结构域是真核细胞转录因子中最丰富类型的DNA结合结构域之一。因为锌指结构域是模块化的，因此这些结构域对于产生有益性质的人工DNA结合蛋白是理想的。专利技术概述本专利技术揭示了包括一个蛋白质转导结构域(PTD)的外源嵌合的锌指蛋白可被有效地转导进培养的哺乳动物细胞中，在此其调节特异性靶基因。因此，包括PTD的人工转录因子可用于产生调节内源基因的蛋白质药物及改变细胞体外和体内行为的蛋白质药物。蛋白质药物的一个优势是其具有限定的制备过程。它们的浓度及由此的作用可以被仔细控制和限制。由于锌指结构域螯合锌离子，在本专利技术之前还不清楚锌指结构域是否可转移穿过生物膜并保持其功能性。在转移期间所述结构域的伸展可导致锌离子释放和丧失。相反，折叠状态可防止转移。另外，锌指结构域在胞外环境暴露于氧化条件可导致半胱氨酸残基之间有害的二硫键形成，从而丧失DNA结合活性。我们现已发现锌指结构域事实上可以转移穿过生物膜。另外，我们发现在转移后这些结构域具有功能并可以调节细胞中的内源基因。因此，一方面，本专利技术特征在于一种蛋白质(例如嵌合蛋白和/或分离的蛋白)，其包括a)一个锌指结构域，及b)一个异源蛋白质转导结构域。所述蛋白质可包括多个锌指结构域，例如2、3、4、5、或6个锌指结构域，或者至少2、3、4、5或6个锌指结构域。在一个实施方案中，所述蛋白质包括一批锌指结构域。所述蛋白质还可包括一或多个如下特征核定位信号，二聚化结构域，细胞靶向结构域，细胞表面蛋白结合结构域，纯化柄(purification handle)和效应子结构域。所述蛋白质还可以包括一或多个非肽主链键或者一个人工氨基酸。所述细胞靶向结构域可包括一个免疫球蛋白可变结构域，生长因子，病毒蛋白的细胞结合结构域，或者胞外蛋白的结合结构域。所述纯化柄可包括一个没有半胱氨酸并可以螯合金属的氨基酸序列，如五-或六-组氨酸。在一个实施方案中，所述锌指结构域是天然存在的，例如是人锌指结构域。在另一个实施方案中，其不是天然存在的。例如，可以人源化锌指结构域，例如通过将许多非DNA接触残基改变为与人锌指结构域中相应残基相同而人源化。在一个实施方案中，所述蛋白质转导结构域和锌指结构域是同一多肽链的成分。所述蛋白质转导结构域和锌指结构域可以间隔至少10、20或50个氨基酸。例如它们可以由一或多个如下结构间隔柔性接头，位点特异性蛋白酶的蛋白酶切割位点(例如位点特异性胞内蛋白酶)，或者功能性结构域。在另一个实施方案中，它们是单独的多肽链的成分。例如，所述链可以通过可还原的键(例如二硫键)或者通过另一种在进入细胞后被裂解的键而附着。在一个实施方案中，所述蛋白质转导结构域包括一个病毒序列，例如来自天然感染人的病毒例如HIV病毒的序列。蛋白质转导结构域例如是HIV TAT蛋白质转导结构域，例如氨基酸序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO1)。所述病毒序列的长度可以是5-50或者8-20个氨基酸。在另一个实施方案中，所述蛋白质转导结构域包括哺乳动物序列，例如来自人蛋白质的序列。在另一个实施方案中，所述蛋白质转导结构域包括一个人工序列，例如从展示文库中鉴别为转导结构域的序列。在一个实施方案中，所述蛋白质转导结构域是细胞特异性转导结构域。术语“异源”是指所述蛋白质转导结构域与锌指结构域不是衍生自同样的蛋白质。例如，所述锌指结构域可以是人工的，而所述蛋白质转导结构域可以衍生自例如病毒蛋白。在一个实施方案中，所述蛋白质在与细胞外表接触后可调节至少一个内源基因在细胞中的转录。所述蛋白质可通过例如在细胞表面或者在小泡形成后穿过细胞的质膜而内在化。例如，所述蛋白质在与细胞外表接触后可调节细胞中的至少一个内源基因、但少于细胞中1％、0.01％或0.001％的基因的转录。由所述蛋白质调节的基因的数目可以例如使用核酸微阵列确定。在许多具体的情况中，所述蛋白质与没有所述蛋白质转导结构域但其它都相同的蛋白质调节同样的基因。典型地，所述蛋白质在不存在另一种因子例如一种人工因子如细胞透化剂(例如洗涤剂)的情况中可从胞外环境转移进入哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述蛋白质包括一个条件化的结构域，其调节蛋白质的另一个结构域的功能，由此所述功能依赖于外源化合物的存在与否。例如，所述条件化的结构域结合一种小分子例如类固醇、FK506、等等。“小分子”是分子量低于4kDa的分子。例如，所述条件化的结构域可包括FK506结合结构域。在一个实施方案中，所述蛋白质在一个分析中可被转导进入至少50、75、80、90或95％的培养的人胚肾(HEK)293细胞中，其中细胞密度是3×105/ml，所述蛋白质存在于胞外培养基中，浓度为100μg/ml，或者浓度低于100μg/ml、50μg/ml、5μg/ml或0.5μg/ml。在一个相关的实施方案中，本专利技术特征在于一种分离的蛋白质，其包括a)一个人工DNA结合结构域，其与细胞内一个天然存在的靶位点结合，亲和性(Kd)为低于75、50、25、20、10、5、2.5、1、0.5或0.05nM；b)一个异源蛋白质转导结构域，其可导致分离的蛋白质穿过细胞的外膜进入细胞中；及c)一个核定位信号。本专利技术特征还在于药物组合物，其包括本专利技术所述的一个可转导的蛋白质和一种药物可接受的载体。所述组合物可进一步包括稳定所述组合物的氧化还原潜力的制剂，例如还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇，所用量为有效降低蛋白质的锌指结构域的半胱氨酸残基之间二硫键形成。例如，所述组合物可包括谷胱甘肽。在一个实施方案中，所述组合物进一步包括锌，例如锌盐如氯化锌或乙酸锌。锌的有益浓度包括1μM-5 mM，1μM-500μM，1μM-200μM，0.05μM-50μM及0.5μM-30μM。在另一个实施方案中，所述组合物基本上没有锌，例如锌的浓度低于0.5 mM。所述可转导的蛋白质可以在大肠杆菌或者另一种原核细胞中作为内含体或者作为分泌的蛋白而表达。在另一个实施例中，所述可转导的蛋白质在真核细胞中表达，例如在哺乳动物细胞、植物细胞或酵母细胞中表达。所述可转导的蛋白质可以例如使用至少一或两个纯化步骤纯化，例如至少两个层析步骤，例如一个亲和层析步骤和一个离子交换层析步骤。所述蛋白质可以是足够纯的，从而在人组织培养细胞(例如，HEK293)中可稳定至少0.5、1、2、3、6、12、24、48或60小时。如果所述蛋白质在所需时间后可检测到，例如不易发生实质上的降解，则可以称其为是稳定的。所述蛋白质可以是至少足够纯的，从而当将大约10μg蛋白质加样于泳道中时其是在考马斯凝胶上唯一可检测的条带。本专利技术的特征还在于一种方法，包括将药物组合物施用给对象，例如药物组合物的量是有效改变对象细胞中基因表达的量或者是导致对象中表型改变的量。所述方法可包括(例如使用医学装置或静脉内输送系统)分次或连续施用多剂量的组合物，例如至少2、3、6、10或20个剂量。当使施用多剂量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合蛋白，其包括：ａ）多个锌指结构域；及ｂ）一个异源蛋白质转导结构域，其有效地将所述蛋白转移穿过细胞膜。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：金晋秀，申铉哲，权兴善，
申请(专利权)人：图尔金株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]